云南‘火把梨’结构基因UFGT及转录因子克隆与分析.docVIP

　　云南‘火把梨’结构基因UFGT及转录因子克隆与分析 1文献综述 1.1.果实花色素苷 果皮色泽形成中花色素苷是重要的色素类群(白新祥等，2006)。截止目前，自然界中已发现了600多种花色素苷类物质。植物中主要含有花葵素、类芍药素、花翠素、矢车菊素、锦葵色素、牵牛花素等6种花色素类型(Groteum morifolium)、月季(Rosa hybrida)和康乃馨(Dianthus caryophyllus)等，因为不能形成飞燕草素而缺少紫色和蓝色的品种。梨果皮颜色是最重要的经济性状之一，是决定梨市场接受度的重要因素，果皮颜色能激起消费者购买和消费的欲望，因为消费者常把这些与成熟和美味联系到一起(Kingand Cliff，2002)。此外，不同国家和地区的消费者对果实颜色的偏好也不一样(Cliff et al.，2002)。新西兰消费者喜欢片红苹果，加拿大的消费者喜欢全红苹果，不列颠哥伦比亚的消费者能广泛接受一系列的苹果。每个国家、地区赠送节日礼物时，对颜色的要求也不尽相同(Iglesias et al.，2008)。果皮颜色是辨别栽培品种的一个重要特征，并且越来越多人对有颜色的育种材料感兴趣。在新西兰(Chagne et al.，2007) .和欧洲，有人正致力于培育一个红色果肉的苹果栽培种。 . 1.2花色素苷积累的基因调控 对花色苷生物合成有影响表(1-1)。第一类是已被广泛研究了的编码色素合成的必需酶类(结构基因或生物合成基因)(Takos et al.，2006b)。另一类是由转录因子组成的调控基因，能影响花色素苷的积累强度和积累模式，而且还广泛调控许多不同的生物合成基因的表达(Goodrich et al.，1992)。有研究显示果皮的红色是由两个互补位点调控的(YB1的等位基因MYB1-1已经被Takos等人(Takos et al.，2006a)鉴定。果实和叶片的红色都是由Rni轨迹控制的(Chagne et al.，2007)。调控基因决定果实色素积累模式的相关研究还比较少。根据Janick等人(Janick et al.，1996)的研究，片红苹果经过杂交后，子代通常是片红或无色且无条纹，这意味着存在具额外作用的遗传基因。在苹果育种工作中，由于基因组选择(CS)的应用减少了世代隔离，并加强了选择强度，显著提高了育种效率，缩短了育种周期，丰富了果实品质的表型，使其成为一种可靠地替代传统果实性状选择的方法(Satish et al.，2012)。 .. 2云南火把梨UFGT、EGA提取试剂盒(E.Z.N.A.TMPlantRNA Kit)提取，反转录试剂盒(Quantscript RT Kit)，DNA割胶回收试剂盒，2 Taq PCRMasterMix Kit与DL marker 2000均购自天根生物技术有限公司和北京康为世纪生物科技有限公司，4S Green无毒型核酸染料购自生工生物工程(上海)股份有限公司；常规化学试剂及药品，购自Sigma公司或者国产AR级试剂；PCR引物及测序引物是由上海上海捷瑞生物工程有限公司合成；测序则是由上海生物工程股份有限公司完成的。 2.1.1.3主要仪器 SANYO-80℃冰箱(ULT2586-4-V46)、Haier冰箱(sc-329)、AIRTECH超净工作台、eppendorf离心机、biochrom紫外分光光度计(LIBYA S22)、DYY-8C型电泳仪(北京市六一仪器厂)、LGIOOB烘箱、TDA温度控制仪、TOMY高压灭菌锅、biometra PCR仪、LG微波炉(EGA提取试剂盒(E.Z.N.A.TMPlantRNA Kit)提取，本试验分别提取了幼叶、花瓣、果皮的总RNA，电泳检测结果如(图2-1)，25S和18S都清晰可见，并于-80℃冰箱保存，用于cDNA第一链的合成。以云南火把梨幼叶cDNA第一链为模板进行同源PCR扩增，得到约为1500bp的PCR扩增产物(图2-2)，该产物片段的大小与预期一致。直接把PCR产物送往上海生物工程股份有限公司进行双向测序，对结果进行拼接得到长度为1465bp的基因片段，编码479个氨基酸的蛋白质(图2-3)。并利用在线软件与其它物种的UFGT氨基酸序列进行BLAST同源比对，结果显示，该基因片段编码的氨基酸序列与苹果(Malus domestica，BAI44431)、克莱门柚(Citrus clementina，XP_006443177) UFGT氨基酸序列的相似性分别是99%、97%，与葡萄(Vitis vinifera，XP_002270947)、野草莓(Fragaria vesca，XP_004301659)UFGT氨基酸序列相似性均为96%，与碧桃(Prunus persica，EMJ19151)、