双光子生物荧光显微技术中的探针问题.pdfVIP

第23卷 第1期 大学化学 2008年2月 双光子生物荧光显微技术中的探针问题 于晓强 陶绪堂 蒋民华 (山东大学晶体材料国家重点实验室 济南250100) 摘要 近年来，双光子材料及其相关应用技术的研究引起了人们的广泛关注，并取得了很好 的进展。其中，双光子生物荧光显微技术受到了特别重视。本文重点介绍这一技术在生物荧光成 像方面的优势，同时深入探讨了该技术面临的缺乏高效双光子荧光探针的问题，总结了双光子荧 光探针材料的发展现状和前景。 活性生物组织与细胞及其内部物质(离子、蛋白质、酶、核糖核酸等)的纵深方向的大深 度、高精度的断层荧光探测和成像，是医学与生命科学领域面临的挑战性课题。20世纪80年 代发展起来的新型高精度显微镜——激光扫描共聚焦显微镜(1aser scanning confocal microsco— PY)，辅以可与被测物质特异性结合的各种荧光探针或标记染料，可以对活细胞的结构及其内 部物质进行实时动态的观测和检测…。激光扫描共聚焦显微镜依赖小孔光阑成像原理隔离 背景光并实现纵深方向的断层扫描。但这一技术依然存在明显缺点：生物组织和细胞内蛋白 质氨基酸残基和血红蛋白等生物大分子发色团对紫外一可见区激发光的吸收、细胞和组织瑞利 散射、检测器端共焦小孔光阑对荧光收集效率的强烈损失(只对未经散射的光子成像)、焦平 面外的激发区域背景荧光干扰和光生物损伤区域大等。最近，以脉冲激光为激发光源的双光 子荧光探测和成像技术的出现为解决这些问题带来了希望，目前已有商品双光子荧光显微镜 出售[2]。但双光子荧光探针的研究则相对滞后【3]，已有的针对激光扫描共聚焦显微镜的单光 子荧光原理开发的商品探针的双光子荧光活性吸收截面偏小，因而所用激发激光的光强偏大， 易造成生物样品热损伤，限制了双光子荧光显微技术的广泛应用。从目前的应用效果看，激光 扫描共聚焦显微镜可以在二维平面上给出高精度的荧光成像，但在三维成像方面仍然存在着 不足之处。对于生命科学的研究工作来讲，给出细胞中生理活动的三维信息是非常重要的，双 光子荧光显微技术恰好具有较大的优势。荧光显微探测技术与荧光探针是相互依存互相促进 的，新的荧光技术需要新的探针，新的探针将使探测技术更加完善。因此，发展高效的双光子 荧光探针材料是一个重要的科学命题。 1 双光子吸收材料的概念 有机分子能够吸收一个光子使其处于前线轨道的电子跃迁到高能级，这一过程为紫外一可 见吸收 引，在此过程中电子吸收一个光子，可称为单光子吸收。最近人们从大量的实验中发 现：在脉冲激光的激发下，具有大的仃电子共轭体系和较大的跃迁偶极距的有机分子能够同 1 时吸收两个光子使其前线轨道的电子跃迁到高能级，这个过程称为双光子吸收过程 J。单光 子吸收和双光子吸收过程遵循不同的选择定律 』。能够发生双光子吸收过程的材料称为双 光子材料。目前经常报道的双光子材料包括有机小分子 J、有机／金属配合物 和大分子 J。 紫外一可见吸收是线性过程，双光子吸收是非线性过程。在两个过程中跃迁到高能级的分子都 能够引发各种光物理过程(如荧光¨ 、激射… 等)和光化学反应(聚合¨引、控释¨纠等)。由于 双光子荧光是长波长激发短波长发射的过程，因此也被称为上转换荧光过程。双光子过程和 单光子过程的区别在于吸收阶段，达到激发态后引发的光物理过程和光化学反应是相似的。 双光子吸收材料之所以引起人们关注，根本原因在于其非线性吸收过程导致的两个基本 特征：(1)双光子吸收过程中，材料的电子跃迁几率与辐照光强的平方成正比，此过程具有高 度的三维空间选择性，因此，可利用紧聚焦的技术，将吸收区域控制在一个入射光波长3次方 大小的空间体积内。(2)双光子吸收过程的辐照光波长在600～lO00nm范围内，其光子能量 远远低于紫外辐照光(波长为250～400nm)的光子能量。材料体系对光能的线性吸收与瑞利 散射均比较小，辐照光的穿透性好。因此，利用双光子技术可以深入材料体系内部实现微米级 分辨率的观测和光控反应。 图l是同一种有机双光子分子在两种吸收过程中产生的荧光现象。当用400nm激光激 发时，得