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ADV质检方法
附录五：无菌检查方法
1材料：
：试剂：
流体硫乙醇酸盐培养基（中国药品生物制品检定所，批号：990303，250克）
改良马丁培养基（中国药品生物制品检定所，批号：990128，250克）
仪器：
PYX-DHS-40x50-BS型隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗仪器厂）
实验方法与步骤：
配制培养基：
准备硫乙醇酸盐液体培养基：称取流体硫乙醇酸盐培养基30g，加蒸馏水1L，加热使之溶解均匀，按15ml/管分装于试管内，116℃灭菌20分钟。
准备改良马丁培养基：称取改良马丁培养基28.9g，加蒸馏水1L，加热使之溶解均匀，按15ml/管分装于试管内，116℃灭菌20分钟。
将硫乙醇酸盐液体培养基和改良马丁培养基分别放于35℃和25℃的培养箱内，无菌生长的可以用于检测。℃以下备用。
2.2接种
待检品按1ml/ 附录六：支原体检查方法
1 PCR方法
1.1材料：
1.1.1样品：
1.1.2对照品：含支原体的培养上清
1.1.3试剂：
TaKaRa Ex TaqTM PCR扩增试剂盒（TaKaRa）
引物（TaKaRa公司合成）：F1： 5’-ACACCATGGGAG(C/T)TGGTAAT-3’
First Stage R1： 5’-CTTC(A/T)TCGACT(C/T)CAGACCCAAGGCAT-3
M78： 5’-AAAGTGGGCAATACCCAACGC-3’
M89： 5’-TCACGCTTAGATGCTTTCAGCG-3’
F2： 5’-GTG(C/G)GG(A/C)TGGATCACCTCCT-3’
Second stage R2： 5’-GCATCCACCA(A/T)A(A/T)AC(C/T)CTT-3’
R34： 5’-CCACTGTGTGCCCTTTGTTCCT-3’
1.1.4仪器与器材：
EBA 12型高速离心机（Ttettich Zentrifugen）
Y6型恒温水浴锅（Grant）
Personal Cycler PCR仪（Biometra）
Power PAC 3000型电泳仪（BIO-RAD）
DYY-Ш33B型电泳槽（北京六一仪器厂）
Fluor-STM MultiImager凝胶成像系统（BIO-RAD）微量移液器：20μl（金花），5-40μl（Labsystems）μl培养上清液，置于沸水浴中煮沸5分钟，取5μl用于检测。
1.2.2两步PCR扩增检测：
取3只EP管，分别标记1，2，3。按下表的配方准备DNA反应混合物，其中的DNA模板分别为（阳性对照）和纯水（阴性对照）。分别加入1，2，3管。
PCR扩增体系组成 (50μl) DNA模板 μl 10× Ex Taq Buffer 5μl 2.5mM dNTP 4μl 25mM MgCl2 3μl 引
物 F1 1μl R1 1μl M78 1μl M89 1μl Ex Taq DNA多聚酶 μl 纯水 μl PCR扩增：按操作手册设置PCR仪的工作程序。
程序设置完毕，即开始PCR扩增。
取3只EP管，分别标记1’，2’，3’。按下表的配方准备DNA反应混合物，其中的DNA模板分别为。分别加入1’，2’，3’管。
PCR扩增体系组成 (50μl) DNA模板 μl 10× Ex Taq Buffer 5μl 2.5mM dNTP 4μl 25mM MgCl2 3μl 引
物 F2 1μl R2 1μl R34 1μl Ex Taq DNA多聚酶 μl 纯水 μl PCR扩增：按操作手册设置PCR仪的工作程序。取10μl反应混合物点样于15%的琼脂糖凝胶上，110V恒压电泳1小时。电泳完毕，用溴化乙锭染色20分钟。
检测：用凝胶成像系统检测，PCR产物大小。并照相保存结果。
管号 1 2 3 1’ 2’ 3’ 第一步PCR - + - - + - 第二步PCR - + - - + - 2培养法
2.1材料：
2.1.1样品：
2.1.2试剂：肺炎支原体肉汤基础（中国药品生物制品检定所，批号981120，40克）
2.1.3仪器：PYX-DHS-40x50-BS型隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗仪器厂）
℃ 20分钟。根据用途另加增补剂或抑菌剂。将以上肉汤基础加入灭活小牛血清和酵母浸液（培养基：血清：酵母浸液=7：2：1），并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。
2.2.2加样
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