蛋白质复性方法及其注意事项.doc

蛋白质复性方法及其注意事项 蛋白前期准备 （1）查阅目标蛋白相关文献，了解其等电点，标签等注意点。 （2）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1-2mMDTT，全程低温，及时处理。 （3）透析Buffer的选择可参考文献。 蛋白复性 包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。 在E.coli中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包涵体蛋白是丧失生物活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体。 包涵体的处理一般包括这么几步：包涵体的洗涤、溶解、纯化及复性。 如果过表达蛋白在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：（1）退一步，优化表达条件；（2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性。这里主要考虑第二种方案。 包涵体的洗涤? 破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 洗涤Buffer：50mM Tris-HCl(pH8.0), 2mM EDTA, 2mM DTT，150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1mg/ml Leupeptin, 1mg/ml Pepstatin,1mM TCEP。 超声时用40-60ml裂解液,因为我们的超声仪很适合用100ml小烧杯,装40-60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会洒出来.菌多就延长超声时间（全程冰浴）。?? 包涵体的溶解 1、对于尿素和盐酸胍的选择： 尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。 盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。?? 2、去垢剂： 温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，可以 增溶几乎所有的蛋白。问题是由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用。 包涵体的复性 1复性： 通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。 2复性的效率： 复性是一个非常复杂的过程，蛋白质的复性效率在20%左右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度，变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。 4、复性中常采用的方法有： 稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。 透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，缺点是易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。 超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。 柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，常用于复性的层析方法有SEC、HIC等。 复性方法 优点 缺点 透析 简单 慢，使用大量缓冲液 稀释 简单 慢 蛋白稀释到很低浓度(10–50 μg/ml) 分子筛层析（柱上） 在一步操作中直接进行自动化复性并纯化 样品体积受限 离子交换层析（柱上） 快速并且简单 直接进行自动化 应该避免使用与离子交换自相反电荷的添加剂 复性的具体方法还要根据前期试验及筛选来确定！ 包涵体的复性还要注意以下几点： 1.首先要获得较高纯度的包涵体。 2.包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施。 3.复性前后均要离心 4.复性不能太快. 5.纯化的最佳条件要摸索和结合相关文献。 6.变性蛋白的浓度 浓度不要太高，一般0.4-0.5mg/ml 左右较适宜，若浓度高了，可稀释至适宜浓度。有些蛋白可能更低，此时需要结合文献和实践，确定最佳浓度。要结合透析前后的浓度，如果透析液加入甘油，这需要结合浓缩比（10%甘油可浓缩20%左右）。 复性Buffer的选择 包涵体复性液