双酚A对硬骨鱼性腺分化作用机制探究.docVIP

双酚A对硬骨鱼性腺分化作用机制探究摘要： [目的] 研究双酚Ａ对硬骨鱼生殖腺性分化的影响并探索其作用机制。 [方法] 运用日本比目鱼的温度决定性别的生物学特性，在鱼卵孵化后的第30天到第100天性分化敏感期内， 利用27℃水温使幼鱼都分化成表型的雄性，从第30天开始，给予幼鱼双酚A 100μg/g的饲料。在第100天青年期和第300天成年期，分别对各组比目鱼样本做病理组织切片，判断其性别和雌雄比例，通过原位杂交分析以及RT－PCR分析，探索它们的作用机制。 [结果] 双酚Ａ对27℃水温饲养下的雄性比目鱼幼鱼都有雌性化诱导作用，100μg/g组成年雌性比例占57%，显著高于27℃对照组（0%）；比目鱼幼鱼出生后第100天时，原位杂交分析显示，芳香化酶P450的mRNA在双酚Ａ组的雌鱼卵巢中，有明显表达，但在雄鱼精巢中不表达；而MIS（苗勒氏管抑制物质）的mRNA在双酚Ａ组的雌鱼卵巢中不表达，却在雄鱼精巢中能见到极其明显的表达。RT－PCR实验也证实了原位杂交的结果。 [结论] 双酚A对日本比目鱼的生殖腺性分化有雌激素样的作用，雌性化作用的机制很可能是诱导了芳香化酶P450的mRNA表达而且抑制了MIS的mRNA表达。此实验研究也为预防相关疾病和保护公众健康提供依据。 关键词： 日本比目鱼； 性分化； 双酚A； 芳香化酶P450 中图分类号：R136.3+1文献标识码： Ａ 双酚A(Bisphenol A,BPA)是苯酚和丙酮的衍生物，它是一种重要的有机化工原料，作为单体物质用来生产聚碳酸酯等高分子材料和塑料剂，应用于食品包装材料、牙科密封剂、婴儿奶瓶等塑料制品[1],再释放进入环境。近年来BPA被认为是一种外源性雌激素，进入体内后能干扰正常激素分泌而影响生殖系统分化和发育[2]，危害公众的健康。但它的雌激素样作用的分子机制仍未完全定论。日本比目鱼是一种生活在日本海水中常见的硬骨鱼，对环境因素非常敏感。它具有XX(雌性)/XY(雄性)性别决定机制[3]。研究表明，基因型雌鱼在性分化时期，如果喂养于18℃低水温下，它们仍然会发育成表型雌鱼。但如果幼鱼性分化时期被喂养在27℃高水温条件下或雄激素喂食下，基因型雌鱼的性别可以被完全转化而发育成为表型的雄鱼[4]。因此，日本比目鱼为研究环境因子对性分化作用的分子机制提供了一个极好的动物模型。为了解释双酚A这类雌激素样化学物对日本比目鱼的生殖腺性分化的作用机制，为预防相关疾病提供依据，我们在27℃高水温下对比目鱼幼鱼喂食BPA，并用雌二醇（17β-estradiol,E2）作为阳性对照，检测鱼类性别的变化以及生殖腺内性别相关基因的表达水平。 1 材料与方法 1.1 仪器和试剂 仪器有高速冷冻小型离心机MX100(TOMY，Japan)；PCR仪（ASTEC,Japan）；培养箱 (ADVANTEC CI410,Japan)；蒸汽高温灭菌仪：高压蒸汽消毒仪BS245(TOMY,Japan)；显微镜（OLYMPUS）。双酚A，购自Wako（日本）公司。 1.2 实验动物 实验中所有雌性日本比目鱼都由人工交配方式，使遗传学雌性和表型雄性交配得来[４]。 幼鱼孵化后饲养在18?C较低水温中直到染毒开始时为止。 1.3 方法 1.3.1 实验染毒 BPA染毒方法是按BPA 100μg/g饲料的比例拌入人工饲料，在27℃高水温下在幼鱼性分化时期喂食幼鱼，即从鱼卵孵化后第30天到第100天。另设18℃普通水温对照组、27℃高水温对照组和雌二醇（E2，1μg/g）阳性对照组。 1.3.2 组织学观察 表型性别的决定是通过第100天（青年期）和第300天（成年期）的比目鱼生殖腺的组织学切片观察来判断的[５]。成年鱼的生殖腺和第100天的小鱼被固定于Bouin’s溶液里，冷藏于4℃过夜，用不同浓度乙醇逐级脱水，包埋于石蜡中，连续切片，每片厚5μm，最后用苏木精－曙红（H.E.）染色。 1.3.3 原位杂交分析 在RNA酶灭活条件下，将第100天的青年期小鱼固定于Bouin’s溶液中，4℃放置过夜，乙醇逐级脱水，石蜡包埋，切片，厚5μm。将组织切片脱石蜡，再加水之后，用1μg/ml的蛋白酶K磷酸缓冲液（PBS）处理5min，室温下，此反应被加入的2mg/ml氨基乙酸终止5min。组织玻片在PBS中漂洗2次后，用4％多聚甲醛PBS溶液固定10min，再于PBS中漂洗二次后，组织切片与1μg/mlDIG标记的反义RNA探针杂交，此探针由TA载体pCR II转录而来，包含日本比目鱼P450arom和MIS的cDNA[6]。在DIG Easy Hyb溶液中于55?C过夜。杂交后的组织切片在50％甲酰胺溶液中漂洗二次，每次30min。再用1μg/