超高效液相色谱法测定大豆异黄酮胶囊中异黄酮含量.docVIP

超高效液相色谱法测定大豆异黄酮胶囊中异黄酮含量【摘 要】 目的 建立同时测定大豆异黄酮胶囊中6种异黄酮含量的超高效液相色谱法（HPLC）。方法 采用Acquity UPLCTM BEH C18柱（1．7 μm，2．1 mm×50 mm），流动相为甲醇-0．05 mol/L乙酸胺（pH4．6），梯度洗脱，检测波长为260 nm，流速为0．4 ml/min，柱温为40℃，外标法测定。结果 大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素分别在0．026 00～0．260 0 mg/ml、0．026 25～0．262 5 mg/ml、0．026 75～0．267 5 mg/ml、0．012 650～0．126 50 mg/ml、0．012 525～0．125 25 mg/ml、0．012 750～0．127 50 mg/ml范围内线性关系良好（r≥0．993 0），加样回收率（6例）分别为：98．5%、98．8%、98．2%、97．7%、98．0%、97．3%。结论 本法快速、简便、准确、灵敏度高、成本低，适用于大豆异黄酮胶囊中异黄酮的含量测定及质量控制。 【关键词】 大豆异黄酮胶囊;异黄酮;超高效液相色谱法;含量测定 大豆异黄酮是大豆生长中形成的一种次生代谢产物，是生物黄酮的一种，也是天然的植物雌激素，具有抗衰老、抗肿瘤、防治骨质疏松、预防心脑血管疾病，以及抗高血压、降血脂等功效。大豆异黄酮胶囊性质稳定，安全有效，在临床上和保健品领域上得到广泛应用[1-2]。 大豆异黄酮又名类黄酮，目前发现的大豆异黄酮包括游离型苷元和结合型的糖苷两类共有12种，其主要成分有大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素。采用传统HPLC法测定时，检验周期长，低含量组分的检出效果不理想[3]。UPLC 的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC 的9、3及1．7倍[4]，本文采用超高效液相色谱法同时测定大豆异黄酮中6种有效成分的含量，快速、准确且成本低廉。 1 仪器与试药 Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪，紫外检测器，Empower 2色谱工作站。 大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素对照品由中国药品生物制品检定所提供，含量测定用大豆异黄酮胶囊20060502由广东康雅生物制药公司提供。甲醇为色谱纯，实验用水为超纯水。 2 实验方法 2．1 色谱条件 Acquity UPLC?TM BEH C-18柱，1．7 μm，2．1 mm×50 mm，甲醇-0．05 mol/L乙酸胺（pH4．6）为流动相，梯度洗脱，洗脱条件见表1；检测波长为260 nm；流速为1．0 ml/min；柱温为40℃；进样量为2 μl。对照品液、样品液及阴性对照液的色谱图如图1所示。 0．05 mol/L乙酸胺溶液（pH=4．6）∶准确称取3．85 g乙酸铵于烧杯中，用适量水溶解转移至1 000 ml容量瓶中，加水500 ml，加入3．00 ml冰醋酸，摇匀，加水至刻度，摇匀。 2．2 溶液制备 2．2．1 对照品溶液的制备 精密称取五氧化二磷干燥至恒重的大豆苷（Daidzin）、黄豆黄苷(Glycitin)、染料木苷(Genistin)、大豆苷元(Daidzein)、黄豆黄素(Glycitein)和染料木素(Genistein)对照品，加甲醇制成每1 ml分别含0．10、0．10、0．10 、0．05、0．05、0．05 mg的溶液，作为对照品溶液，用0．22 μm的微孔滤膜过滤，即得。 3 实验结果 3．1 线性关系 分别称取对照品适量，精密称定，用甲醇制成每1 ml中含大豆苷1 mg、黄豆黄苷1 mg、染料木苷1 mg、大豆苷元0．5 mg、黄豆黄素0．5 mg、染料木素0．5 mg的混合溶液，摇匀，作为储备液。分别精密量取储备液0．25、0．5、1．0、1．5、2．0、2．5 ml置于10 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度。按上述色谱条件下平行测定3 次，以峰面积的平均值Y对浓度X（mg/ml）进行线性回归。计算大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素的回归方程 3．2 重复性试验 取大豆异黄酮胶囊，按“2．2．2”项下方法平行制备5份样品溶液，分别测定其含量，大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的含量测定结果的RSD分别为0．8%、0．9%、0．5%、1．0%、1．3%、1．6%。 3．4 检测限和定量限 将对照品溶液逐步稀释后进样，以信噪比为3 计，大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的最低检测限浓度分别为5．2、4