人脑源性神经因子BDNF酶联免疫分析ELISA.docVIP

人脑源性神经因子(BDNF)酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 96t 目 的： 本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中人脑源性神经因子(BDNF)的含量。 检测范围： 5.0ng/L -100ng/L 实验原理： 本试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中人脑源性神经因子(BDNF)水平。用纯化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被抗原的微孔中依次加入人脑源性神经因子(BDNF)，再与 HRP 标记的抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP酶的催化下转化成蓝色， 并在酸的作用下转化成最终的黄色。 颜色的深浅和样品中的人脑源性神经因子(BDNF)呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值） ，通过标准曲线计算样品中人脑源性神经因子(BDNF)浓度。 试剂盒组成： Reagent Quantity 酶板 12well×8strips 标准: 480pg/mL 1×0.5ml 标准品稀释液 1×1.5ml 1×6ml 样品稀释液 1×6ml 1×6ml 显色剂B液 1×6ml 终止液 1×6ml 30倍浓缩洗涤液 1×20ml×30flod 说明书 1 封板膜 2 密封袋 1 样本处理及要求： 1. 血清：室温血液自然凝固 10-20 分钟，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。 仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后， 离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万/ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保 存备用。标本融化后仍然保持 2-8℃的温度。加入一定量的 PBS（PH7.4） ，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能 马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融. 7. 不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤： 标准品：其浓度为1,00pg/mL(贮液)。先将其稀释为100pg/mL(标准曲线最高浓度)后，再准备5个稀释标准品的EP 管，每个EP 管中加入150μL 的标准品稀释液，如图所示依次倍比稀释成100pg/mL, 50pg/mL,25pg/mL, 12.5pg/mL, 6.25pg/mL, 3.12pg/mL,，标准品稀释液(0pg/mL)直接作为空白孔。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液 Tube 0 1 2 3 4 5 pg/mL 1.00 50 25 12.5 6.25 3.12 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同） 、待 测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40μ l，然后再加待测样品 10μ l（样品最终稀释度为 5 倍） 。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。 4. 配液：将 20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 20 倍稀释后备用。 5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去， 如此重复 5 次，拍干。