植物内生细菌的研究与应用 - yzxzcom.DOCVIP

植物内生细菌的研究与应用 1、研究意义 植物内生菌是植物微生态系统中的重要组成部分，在长期的协同进化中，与植物形成了互惠互利的关系。内生菌生物学特性、动力学规律、群落生态组成，现已成为国内外学者研究的热点。随着其研究领域的不断拓宽和研究方法的不断深入，内生菌在科研上、农业生物防治、医疗卫生等领域中的应用也越来越广泛。虽然内生菌的研究经过几十年，但是目前植 物内生菌的研究仍处于起步阶段，人们对于内生菌知之甚少，对内生菌的开发和应用刚刚展开。 2、研究进展 2.1 柑橘内生细菌的研究与应用 柑橘是世界第一大水果，在世界140多个国家和地区都有栽培。我国不仅是世界柑橘的起源地，也是柑橘工业大国之一，柑橘产业已成为推动我国新农村建设的支柱产业之一[1]。然而，柑橘病害严重影响到柑橘产业的发展，柑橘黄龙病（Citrus huanglongbing，简称HLB）是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害之一[1]，严重影响到柑橘产业的发展。柑橘黄龙病病原菌（Candidatus Liberibacter asiaticus）是一种韧皮部杆菌属类细菌，属于革兰氏阴性细菌[2]。对柑橘黄龙病的研究，在黄龙病分子检测[3]，传播虫媒，流行规律，病原菌基因组DNA序列[4]，控制技术等方面已有过许多报道。作者前期研究发现，在感染黄龙病的柑橘植株上，存在着同个器官感染状态不同，如病株一部分叶（茎、根）感染，另一部分无感染；同个部位感染状态不同，如病株上部一部分叶（枝）感染，另一部分无感染。这种病株间不同器官、不同部位病原分布的差异性的原因是什么，是否与植株内生菌的分布有关，这一现象国内外的相关研究未见报道。柑橘内生细菌的研究前人有过报道，Lacava等从健康柑橘植株体内分离得到的萎蔫短小杆菌（Curtobacterium flaccumfaciens），能够明显减弱由苛养木杆菌（Xylella fastidiosa）引起的杂色褪绿病(Citrus variegated chlorosis,CVC)的症状[5, 6]。Araújo等从幼小柑橘叶片中分离得到很多细菌以及真菌，其中可以引起柑橘黑斑病的病原菌（Guignardia citricarpa）所分泌的代谢产物可以抑制一些芽胞杆菌（Bacillus）的生长[6]。然而，关于柑橘黄龙病植株内生细菌研究报道很少，仅见王爱华等研究了柑橘黄龙病植株和柑橘健康植株内生细菌种类存在一定差异[7]，而同一棵柑橘黄龙病植株不同部位内生细菌分布差异的研究未见报道。 植物内生细菌（Endophyte bacterium）被公认的定义是指那些在其生活史的一定阶段或者全部阶段生活于植物的各种组织和器官内部的细菌[8]。这样的细菌长期以来生活在植株体内并在某种程度上与植株形成了互利互助的关系。植物内生菌几乎存在于所有目前已研究过的植物中其分布广、种类多。研究表明，感染内生菌的植物宿主往往具有生长快速、抗逆境、抗病害、抗动物危害等优势，比未感染植株更具生存竞争力[9]。对于柑橘黄龙病植株，其黄龙病原在病株不同方位和部位的分布是否一致，不同方位、不同部位、不同黄龙病状态的柑橘器官内生细菌分布是否存在着差异，这些问题尚不清楚。 本研究拟采用Nested-PCR检测方法对柑橘黄龙病植株不同部位叶片进行黄龙病病原的检测，并采用纯培养的方法对柑橘（红心柚）黄龙病植株不同部位（上、中、下）和不同方位（东、西、南、北）叶片，枝条以及根部内生细菌进行分离、鉴定，统计各类内生细菌的在柑橘黄龙病植株不同部位的分布数量，分析柑橘黄龙病植株不同部位内生细菌分布特性及与黄龙病病原菌分布之间的相关性，为柑橘黄龙病的防治，柑橘内生细菌开发与利用奠定基础。 （1）柑橘黄龙病株内生细菌分离与鉴定 根据菌落形态的差异，从红心柚黄龙病株不同部位叶片、枝条和根部共分离出26株内生细菌，其中叶片10株，枝条14株，根部2株。利用16S rDNA鉴定（表1），结果表明，26株内生细菌分别属于10个属，其中芽胞杆菌属（Bacillus）10株，短小杆菌属（Curtobacterium）4株，埃希氏菌属（Escherichia）4株，肠杆菌属（Enterobacter）2株，短短芽胞杆菌（Brevibacillus）、短波单胞菌属（Brevundimonas）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、不动杆菌属（Acinetobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）细菌各1株。分离的芽胞杆菌属菌株属于6个不同的种，包括枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、蜡状芽胞杆菌（Bacillus cereus）、短小芽胞杆菌（Bacillus pumilus）、弯曲芽胞杆菌（Bacillus flexus）