高质量果蝇基因组DNA的抽提1实验.docVIP

湖北科技学院 遗传学实验报告 实验名称 SDS法高质量抽提果蝇基因组DNA 实验器材 玻璃棒 烧杯 高速离心机 1.5ml离心管若干 枪头 水浴槽 分析天平 移液枪 紫外光分析仪 实验材料 活体果蝇若干只 实验药品 1 mol/L Tris.HCl(pH=7.6) 1 mol/L Tris.HCl（pH=9.0） 0.5 mol/L EDTA(pH=8.0) 10% 十二烷基硫酸钠（SDS） 缓冲液A(100 ml)[含Tris.HCl(pH=9.0) 0.1mol/L、EDTA.2Na (pH=8.0) 0.1 mol/L、SDS 1%] 8 M 醋酸钾（100 ml） Tris平衡酚（pH=8.0） 氯仿 TE[含终浓度10μM Tris.Cl(pH=7.6)，1μM EDTA(pH=8.0)] 100ml 异丙醇 实验目的 掌握动物基因组DNA抽取的操作过程，了解DNA提取的意义。 熟悉DNA的提取步骤和了解DNA定量测定的原理、方法。 实验原理 核酸是重要的生物大分子之一，脱氧核糖核酸（DNA）是核酸的一种，DNA是绝大多数生物（除少数RNA病毒外）记录、存储、传递遗传信息的分子。近年来，分子生物学技术迅速发展，在分子遗传学研究领域的诸多方面涉及到抽提基因组DNA的方法。DNA的提取是进行PCR扩增、Southern杂交、限制性片段长度多态性分析等实验的基础。 使用消化缓冲液，使DNA从细胞中释放出来，65摄氏度温水浴可加速DNA溶解，酚.氯仿.异戊醇抽提可以将蛋白质与DNA分离，冷的异丙醇沉淀DNA，70%的乙醇洗去DNA表面的残留的有机溶剂。 药品配制 药品配制 一、储存液的配制 1.1 1 mol/L Tris.HCl(pH=7.6) 在800 ml水中溶解121.1gTris碱，加入浓盐酸60ml调节pH值至7.6，应在溶液冷却至室温后最后调定pH值，加水定容至1L,分装后高压灭菌。 1.2 1 mol/L Tris.HCl（pH=9.0） 在800 ml水中溶解121.1gTris碱，加入浓盐酸（大约30多ml）调节pH值至9.0，应在溶液冷却至室温后最后调定pH值，加水定容至1L,分装后高压灭菌。 1.3 0.5 mol/L EDTA(pH=8.0) 在800 ml 水中加入186.1g 二水乙二胺二乙酸二钠，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节pH值至8.0（约需20g NaOH颗粒），然后定容至1L，分装后高压灭菌。 1.4 10% 十二烷基硫酸钠（SDS） 在900ml 水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，加水定容1L。分装备用。无需灭菌。 二、试剂的配制 2.1 缓冲液A(100 ml)[含Tris.HCl(pH=9.0) 0.1mol/L、EDTA.2Na (pH=8.0) 0.1 mol/L、SDS 1%] 按下列比例加入储存液： 1 mol/L Tris.HCl（pH=9.0）：10 ml 0.5 mol/L EDTA(pH=8.0): 20 ml 10% 十二烷基硫酸钠: 10 ml 加适量的水定容至100 ml。 2.2 8 M 醋酸钾（100 ml） 将78.56g无水醋酸钾溶解于90ml去离子水中，定容至100 ml。 2.3 Tris平衡酚（pH=8.0） 2.4 TE[含终浓度10μM Tris.Cl(pH=7.6)，1μM EDTA(pH=8.0)] 100ml 按下列比例加入储存液： 1 mol/L Tris.HCl(pH=7.6)：100μl 0.5 mol/L EDTA(pH=8.0): 200μl 加适量的水定容至100 ml。 实验步骤 实验步骤 1、实验室乙醚已用完，将果蝇培养瓶放入冰箱内冷冻，代替乙醚麻醉，瓶口应朝下放置，冷冻约5min。 2、取两支1.5ml离心管，每支离心管装入15只果蝇，再次放入冰箱内，冷冻约5min。 3、加入90μl缓冲液A。 4、用烧秃的枪头将果蝇充分地捣碎，放回冰箱里。（枪头大小接近与离心管底部大小，避免捣碎不充分） 5、取出后，放在超恒温水槽，70℃水浴中温浴30min，每1min旋转混匀一次，使离心管内液体受热均匀。 6、加入15μl醋酸钾，混匀（使离心管慢慢上下倒置，不能震荡混匀）。 7、放入冰箱冰浴30min。 8、13000rpm离心15min。 9、将上清转移至新的离心管，除去任何沉淀或界面杂质。 10、加入1倍体积的氯仿（约90μl），充分混匀（不是振荡）。 11、13000rpm离心5分钟。 12、重复（9）～（11） 13