外科临床分散菌耐药性测试和ESBLs细菌性质基因型分析.docVIP

　　外科临床分散菌耐药性测试和ESBLs细菌性质基因型分析 --前言 本研究2000年9月~2002年9月期间江西医学院第一、二、三等三所附属医院外科临床常规分离菌，进行菌谱及耐药性分析，探讨上述医院外科临床分离菌中的细菌菌种分布、耐药情况及产 ESBLs 菌在三所医院的耐药情况；对2001年9月~2002 年5月间通过初筛及确认试验的产 ESBLs 菌进行质粒及染色体 DNA 提取，特定引物行耐药基因 PCR 扩增，研究产 ESBLs 耐药基因的分布类型。通过以上研究旨在提供近年南昌市三所教学医院外科临床分离菌的细菌学特征、耐药状态及产 ESBLs 菌耐药基因型的相关信息，为今后的研究提供资料。 材料与方法 一、 主要试剂和仪器 1．主要试剂： 二、 实验方法 1、资料调查：回顾性调查南昌市三所教学医院微生物检验科 2000 年 9 月-2002 年9 月从外科住院患者送检的各种标本中的常规分离菌（需氧菌）和药敏结果。 2、标本采集： 三所教学医院2000年9月~2002年9月外科住院病人的切口分泌物、引流物、脓液、尿液、胸腹水、胆汁、痰液及血等临床标本，收集后即送检验科。 3、ESBLs 初筛及表型确证实验： A、在琼脂扩散药敏试验中，凡头孢他啶的抑菌环直径≤22mm，头孢噻肟或氨曲南≤27mm 时应高度怀疑为产 ESBLs 菌株，应进一步行确认试验。 B、表型确证试验：用头孢他啶（30μg/片）和头孢他啶加克拉维酸（30μg /10μg）；头孢噻肟（30μg /片）和头孢噻肟加克拉维酸（30μg/10μg）分别测量两种纸片单独及加克维酸的抑菌环直径，加克拉维酸/不加克拉维酸的抑菌环直径≥5mm可确认为产ESBLs菌株。质控菌株：大肠埃希氏菌 ATCC25922（≤2mm），肺炎克雷伯氏菌ATCC700603（≥5mm）。 4、β-内酰胺酶的检测： 确认为产 ESBLs 的菌株进行β-内酰胺酶的检测。用 PH6.0 磷酸缓冲液配制青霉素悬液 6000μg/ml，取该液 0.1ml 置于微量稀释板凹孔中，挑选检测菌株数个菌落混悬于其中，摇动 30min，静置室温中 1h，加淀粉液 2 滴，再加碘液 1 滴，混合，立即观察颜色变化，阳性者当加入碘液后，首先立即出现蓝色，如在 10min 内消失蓝色，提示该菌产生β-内酰胺酶。 5．质粒 DNA 的提取(碱裂解法)： A. 将细菌接种于 2ml 含抗生素的 LB 中，37°C 培养过夜(18 小时)。我们选择氨苄青霉素，按 60μg/ml 计算。（氨苄贮存液浓度为1g/5ml）实际操作过程中，LB 培养液用量超过 2ml，可先将含菌培养液在 3000 转/分钟离心 5 分钟，取菌体沉淀重悬于 2ml LB 培养液中。 B. 将 1.5ml 培养物倒入微量离心管中，12，000 转/分钟离心 30 秒，把细菌沉淀重悬浮于 200μl 溶液 I 中，振荡几秒；加入 200μl 溶液 II，振荡几秒；加入 200μl 溶液 III，振荡几秒。 C. 用微量离心机离心（4℃，12000 转，离心 1min，再 18000 转，离心 1min，再 12000 转离心 1min），将上清转入另一离心管中，加入360μl 异丙醇。冰上放置 5min。于 4°C 以 18000 转/min 离心 10min。将沉淀重悬于 100μl TE 中。 结果 从表 3 可见，三种常见菌对氨苄青霉素的耐药率都非常高，均在 95%以上，但在加用β-内酰胺酶抑制剂舒巴坦后，大肠埃希氏菌对其的耐药率有较大幅度的降低而其余两种菌则无明显改变。哌拉西林则仍是铜绿假单胞菌的首选青霉素类抗生素。三种细菌对头孢菌素抗生素的耐药率可看出，对 I、II 代头孢菌素耐药率较高，III 代头孢菌素的耐药率则相对低。在对氨基糖甙类抗生素中，则丁胺卡那的耐药率相对其他品种要低。在以上各种抗生素中，亚胺硫霉素在三种外科常见临床分离菌中的耐药率最低，分别为 0.8%、6%、23.1%。从表 4 可见，金黄色葡萄球菌对苯唑青霉素的耐药率为 59.8%，其余青霉素类抗生素则全部耐药。青霉素类抗生素加用β-内酰胺酶抑制剂后，则耐药情况有较好的改观；在对喹诺酮类抗生素的耐药情况中，则显示临床应用较早期的品种如诺氟沙星、氧氟沙星的耐药率高，而较新的品种如左氧氟沙星的耐药率只有 19.4%。万古霉素仍是治疗革兰氏阳性球菌感染的有效抗生素。 …………………… 四、材料与方法……………… 7 . 五、结果………………14. 六、讨论………………21. 七、小结………………29. 八、致谢………………30. 讨论 一、南昌市三所教学医院外科临床分离菌菌谱 细菌耐药与滥用抗生素关系极大，传统的经典细菌培养方法需时过长，不能满足临床需要，先进方法难以在欠发达