双苯氟嗪对谷氨酸致海马神经元损伤的保护作用.doc

　　双苯氟嗪对谷氨酸致海马神经元损伤的保护作用 ：吴洋 张永健 苗庆峰 薛健梅 高霄飞 【摘要】 目的 观察双苯氟嗪(Dipfluzine，Dip)对谷氨酸损伤海马神经元的保护作用，并探讨其作用机制。方法 以原代培养的海马神经元作为研究对象，用谷氨酸建立海马神经元损伤模型，通过测定细胞存活率，乳酸脱氢酶(LDH)泄漏率和胞内游离钙浓度(Ca2+)变化，观察双苯氟嗪对谷氨酸致海马神经元损伤的保护作用。结果 双苯氟嗪可显著提高谷氨酸损伤海马神经元存活率，降低LDH泄漏率，对谷氨酸诱导的海马神经元细胞内Ca2+升高有明显的抑制作用。结论 双苯氟嗪对谷氨酸致海马神经元损伤具有保护作用，其机制可能与其抑制谷氨酸诱导的细胞内钙超载有关。 【关键词】 双苯氟嗪 谷氨酸 海马神经元 细胞内钙超载 研究表明，在脑缺血和脑缺血再灌注的短时间内，兴奋性氨基酸表现为大量释放状态，在脑缺血引起的神经元死亡中起重要作用［1］。双苯氟嗪(Dip)作为新型钙拮抗剂，能够选择性扩张血管、增加脑血流、改善脑微循环及脑缺血能量代谢、对亚硝酸钠和戊巴比妥钠造成的小鼠学习记忆障碍以及氯化铝(AlCl3)致阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)模型大鼠的行为及学习记忆障碍有改善作用［2］。能够改善皮质功能紊乱和脑内兴奋性与抑制性氨基酸释放失调，对脑缺血大鼠起脑保护作用［3］。本实验通过建立谷氨酸对体外原代培养的海马神经元兴奋性毒性损伤模型，拟在细胞水平观察兴奋性氨基酸对神经元的毒性作用，并观察Dip对损伤的干预作用，为开发Dip在缺血性脑血管病及其他疾病中的应用提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1．1 动物 新生SD大鼠(24 h内)，雌雄不限，河北医科大学实验动物中心提供。 　　1．2 药品和试剂 Dip (河北医科大学药学院)；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；高糖培养基(DMEM)、多聚赖氨酸、二甲亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑盐(MTT)、Fluo-3／AM、乙二醇四乙酸酯(EGTA)、台盼蓝(美国Sigma公司)；胎牛血清(兰州民海生物制品公司)；Neurobasal A、B27 supplement、胰蛋白酶、羟乙基哌嗪乙烷磺酸(HEPES)、triton X-100(美国Gibco公司)；青霉素、链霉素(华北制药股份有限公司)；谷氨酸钠(Glu)华美生物；细胞外液(mmol／L) NaCl 145.0，KCl 3.0，HEPES 10.0，CaC123.0，葡萄糖8.0；HEPES缓冲液［4］，其他试剂均为国产分析纯。 　　1．3 仪器 VD-1320型超净工作台(哈尔滨市东联 电子 技术开发有限公司)；CO2培养箱(日本Sanyo公司)；解剖显微镜(日本Olympus公司)；XDS-1B型倒置生物显微镜(重庆光电仪器有限公司)；激光共焦显微镜(Leica公司)；FLUOstar galaxy多功能测定仪(德国BMG公司)。 　　1．4 实验方法 　　1．4．1 大鼠海马神经元培养 出生24 h内的SD大鼠，无菌条件下断头，在不含钙镁离子的Hanks液(D-Hanks液)中取海马组织，解剖显微镜下剔除脑膜及血管，剪切成约1mm×1mm×1mm的小块，0.125％胰酶37℃消化约20min。用含体积分数为10％胎牛血清的DMEM终止消化并洗涤2次，制成细胞悬液，调整细胞密度为1～2×106/mL，0.4％台盼蓝排斥试验检查，细胞存活率＞95％。将制备好的细胞悬液加入预先铺敷有多聚赖氨酸的培养板中，置37℃、5％CO2培养箱内培养。24 h后吸出培养液，换用体积分数为2％ B27的无血清培养液，每72 h半量更换含体积分数为2％B27的无血清培养液。 　　1．4．2 海马神经元谷氨酸损伤模型的建立 将培养至第7天的神经元，随机分为4组。以不含血清的DMEM液洗2遍后，损伤组加入含谷氨酸DMEM液。使其终浓度分别为0.1、0.5、1mmol/L，空白对照组加入等体积DMEM液，37℃孵育10min后，弃去上清，以HEPES缓冲液洗2遍，换NEUROBASAL-A Medium(NBM)培养。空白对照组除所加溶液不含谷氨酸外，其它处理步骤均同谷氨酸组，37℃培养24h。 　　1．4．3 Dip对原代培养海马神经元谷氨酸损伤的保护作用 细胞培养与造模方法均同前，随机分为5组。根据损伤模型结果选定损伤组谷氨酸终浓度为1mmol/L，保护组Dip终浓度分别为0.1、1.0和10μmol/L。取培养7d的海马神经元，弃去培养基上清，将1mmol/L谷氨酸溶液加入相对应各组的培养孔内，37℃孵育10min后，弃去上清，以HEPES缓冲液洗2遍，空白对照组和模型对照组换NBM培养。Dip各浓度组再加入不同浓度Dip