实时荧光定量PCR检测人IL9 mRNA方法的建立及应用.doc

　　实时荧光定量PCR检测人IL9 mRNA方法的建立及应用 【摘要】 目的： 建立检测人白介素9 (interleukin9，IL9) mRNA的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR, qRTPCR)方法。方法： 分离人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)，经PMA和离子霉素刺激活化后提取总RNA并逆转录成cDNA。扩增产物与pMD18T载体连接构建质粒标准品。采用qRTPCR方法检测IL9 mRNA的表达水平。评价该方法的线性及特异性，应用该方法检测Graves病患者PBMC中IL9 mRNA 表达水平。结果： 建立了人IL9的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。该法的标准曲线相关系数r2为0.995～0.998，熔解曲线分析产物为单峰。Graves病患者PBMC中IL9 mRNA的相对表达水平明显高于健康对照组(Plt;0.01)。结论： 建立的检测人IL9 mRNA的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法灵敏、特异性好，为进一步临床应用提供了实验基础。 【关键词】 白细胞介素9; 实时荧光定量PCR; SYBR GreenⅠ 　　[Abstract] Objective: To establish a SYBR GreenⅠ based realtime fluorescence quantitative PCR (qRTPCR) method for detection human interleukin9 (IL9) mRNA expression. Method: The specific primers an IL9 gene. Total RNAs human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) ulated by PMA and ionomycin, then the RNAs id standards ethod an IL9 mRNA in PBMCs from patients ethod. Results: The coefficient of correlation of the standard curve of this method elting curve analysis shoan IL9 mRNA in GD group ethod to detect IL9 by SYBR GreenⅠbased qRTPCR ethod of qRTPCR for detection of human IL9 expression. 　　[Key e fluorescence quantitative PCR; SYBR GreenⅠ 　　早先认为IL9是由Th2细胞分泌的一种细胞因子，在抗寄生虫感染及过敏性哮喘中发挥重要作用。近期研究发现有一种新的CD4+T细胞亚群，主要分泌IL9及IL10，称之为“Th9细胞”, 在炎症反应及自身免疫性疾病中发挥重要的作用[1-3]。我们建立了一种检测人IL9 表达的实时荧光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR, qRTPCR)方法，并应用于Graves病患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中人IL9 mRNA的检测，为进一步研究IL9在临床中的应用提供了实验手段。 　 　1 材料和方法 　　1.1 材 料 　　1.1.1 研究对象 Graves病患者组22例(男5例，女17例)，平均年龄(31.4±9.4)岁，均为经江苏大学附属人民 医院 确诊的初诊患者。健康对照组20例(男5例，女15例)，平均年龄(29.6±10.3)岁，无慢性疾病及自身免疫性疾病。 　　1.1.2 主要试剂和仪器 人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物技术有限公司)，RPMI1640培养基(Gibco公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)，乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)、离子霉素(Sigma公司)，Trizol(Invitrogen公司)，逆转录试剂盒FSK101(ToYoBo公司)，rTaq酶、dNTPs、10×PCR 缓冲液、pMD18T载体、BamH Ⅰ 、Hind Ⅲ(TaKaRa公司)，荧光定量PCR试剂盒Platinum SYBR Green qPCR SuperMixUDG l肝素抗凝静脉血，使用人淋巴细胞分离液分离PBMC， 用RPMI1640完全培养基调