海蜇酶解多肽制备及其抗肿瘤活性研究.doc

　　海蜇酶解多肽制备及其抗肿瘤活性研究 【摘要】目的　研究海蜇活性肽制备与抗肿瘤活性。方法　海蜇先经正交试验确定最佳酶解条件，然后将酶解物离心得到海蜇活性肽粗品。粗品经超滤、SephadexG-15凝胶层析、冷冻干燥纯化得到海蜇抗肿瘤活性肽，通过MTT法及Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞测定了其对肿瘤细胞体外增值的影响。结果　碱性蛋白酶在温度为55℃，料液比为1:2，加酶量为1000 U/g，时间为4h的酶解条件下对海蜇进行酶解，酶解液中的氨基氮含量为41.3mg/100ml。从海蜇中分离纯化得到活性肽，MTT法表明：其对肿瘤细胞的增殖有较强抑制作用，且抑制作用具有明显量效依赖关系；Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术显示该肽可诱导肿瘤细胞凋亡。结论　经碱性蛋白酶酶解制备的活性肽对肿瘤细胞有明显的抑制作用，并能诱导肿瘤细胞凋亡。 【关键词】海蜇　酶解　抗肿瘤活性　活性肽 【Abstract】Objective To purify the anti-tumor activity peptide from jellyfish (Rhopilem aesculentum). Methods: First, the orthogonal experiment jellyfish. Then, crude product atography and antitumor activity peptide ethod and double-labeled floetry Annexin V-FITC/PI ined the antitumor activity of peptide. Results Using alkaline protease at a temperature of 55℃, e amount of 1000 U / g, hydrolysis time e jellyfish, and the hydrolyzate amino nitrogen contented in the product is 41.3mg/100ml. Purified from the jellyfish in a variety of active peptides, MTT method shoor cell proliferation etry induced apoptosis of the tumor cells and apoptosis in a dose-dependent. Conclusion The peptide from jellyfish hydrolysate could significantly restrain tumor cells multiplication and induce tumor cells apoptosis. 【Key e anti-tumor activity active peptides 海蜇( Rhopilem aesculentum)俗称“鮓鱼”，隶属于腔肠动物门(Coelentera)、钵水母纲(Scyphozoa)、根口水母目(Rhizostomeae)、根口水母科(Rhizostomatidae)，海蜇属(Rhopilema)的无缘膜动物。海蜇的蛋白占其干重的50％，其氨基酸成分种类繁多，必须氨基酸含量丰富。海蜇等海洋生物为了适应高盐、高压、低温、缺氧等极端的海洋生活环境，其蛋白质的氨基酸组成与序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，在种类和数量上也远远超过陆地蛋白资源。在种类繁多的海洋生物蛋白氨基酸序列中，潜在着许多具有生物活性的氨基酸序列，用特异的蛋白酶水解，就能释放出有活性的肽段。 抗肿瘤肽是一种具有抗肿瘤效果的生物活性肽（biologically active peptides,简称BAPP）。目前已从海绵、海鞘、海兔、海藻、海苔虫、鲨鱼、珊瑚以及海洋微生物中分离出2万余种天然产物,其中不少化合物显示出明显的抗肿瘤活性,一些化合物已被作为抗肿瘤候选药物进入了临床前或临床研究阶段[1-3]。但海蜇抗肿瘤活性肽的研究尚处于空白，对其深加工技术与理论也甚少有研究[4]。因此，本研究拟利用浙江沿海丰富的水产品资源，运用最新的蛋白质提取及纯化工艺，对海蜇蛋白进行深度研究和开发，生产出具有特殊功能的活性肽产品。同时对海洋经济发展也将起到积极的推动作用，也会对海蜇的高值化利用提供实验依据。 1　实验材料和试剂与仪器 1.1 材料与试剂 海蜇购自舟山市场，用温水浸泡洗涤以除去明矾和盐分并沥干，切成条状，于水中浸泡12h，取出沥干，放入DS-1高速组织捣拌机中捣碎匀浆，-20℃冷藏备用；胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司；