辛硫磷和灭多威混配对雄性小鼠生殖细胞的毒性作用.docVIP

　　辛硫磷和灭多威混配对雄性小鼠生殖细胞的毒性作用 ：李宏辉， 刘秀芳， 马潇， 张国奇 【摘要】 目的 观察辛硫磷和灭多威对雄性小鼠生殖细胞的联合毒性作用。方法 选择健康成年雄性昆明种小鼠64只，随机分为两批，每批随机分为4组，每组8只，分别为：阴性对照组(灌胃等容量蒸馏水)、辛硫磷组(1/80LD50，25mg/kg 体重)、灭多威组(1/80LD50，0.125mg/kg体重)、灭多威+辛硫磷混配组(1/80LD50+1/80LD50，0.125mg /kg +0.125mg/kg)。第一批实验动物连续经口染毒4d，每天1次，于染毒后第5天颈椎脱臼法处死，取小鼠右侧睾丸进行制片观察睾丸微核。第二批小鼠连续经口灌胃染毒30d，每天1次，于末次染毒后处死，测量小鼠脏器重量，精子参数(精子计数、活率和畸形率)，睾丸生殖细胞的凋亡。结果 辛硫磷、灭多威单剂使睾丸生殖细胞微核率明显增加，精子活率降低、精子畸形率增加(Plt;0.05或Plt;0.01)。辛硫磷+灭多威混配引起睾丸生殖细胞微核率明显增加，精子活率降低、精子畸形率增加(Plt;0.05或Plt;0.01)，存在交互作用。结论 辛硫磷和灭多威混配对雄性小鼠生殖系统存在联合毒性作用，使睾丸生殖细胞微核率增加、精子活率降低、精子畸形率增加，睾丸生殖细胞凋亡水平增加，均表现为拮抗作用;辛硫磷和灭多威混剂可能是通过诱导生殖细胞凋亡的和生殖细胞微核率增加，进而影响精子的质量。 【关键词】 辛硫磷;灭多威;联合作用;生殖细胞毒性 调查显示，我国杀虫剂的混配类型中，有机磷类农药中涉及最多的是辛硫磷，而氨基甲酸酯类则依次为灭多威、呋喃丹，辛硫磷和灭多威混配是我国应用最广泛的杀虫剂之一[1]。由于混配农药的大量生产和使用，混配农药中毒和死亡病例迅速增多，严重危害使用者的健康。本次研究通过观察农药辛硫磷与灭多威混配对雄性小鼠睾丸组织形态及生殖细胞毒性作用，探讨两者混配对睾丸的毒性损伤及其损伤机制，为今后进行人群流行病学研究及农药的健康危险度评价提供实验室依据。 　 　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 实验动物 健康昆明种雄性小鼠(普通级，动物合格证号：SCX(宁)2005-3001，由宁夏医科大学实验动物中心提供)，体重18～22g，共64只。 　　1.1.2 受试物 40%辛硫磷乳油，通化通柳农药化学有限责任公司生产;灭多威90%可溶性粉剂，上海杜邦农化有限公司生产。 　　1.1.3 主要试剂 细胞凋亡检测试剂盒 (MK1020)、DAB显色剂均购于武汉博士德生物工程有限公司。 　　1.2 实验动物分组和染毒方法 　　64只成年健康雄性昆明种小鼠随机分两批，每批随机分为4组，每组8只，分别为：阴性对照组(灌胃等容量蒸馏水)、辛硫磷组(1/80LD50，25mg/kg 体重)、灭多威组(1/80LD50，0.125mg/kg体重)、灭多威+辛硫磷混配组(1/80LD50+1/80LD50，0.125mg/kg+0.125mg/kg)[2]。第一批实验动物连续经口灌胃染毒4d，每天1次，于染毒后第5天颈椎脱臼法处死，取小鼠右侧睾丸进行制片观察睾丸微核。第二批实验动物连续经口灌胃染毒30d，每天1次，于末次染毒后第2天颈椎脱臼法处死，分离小鼠双侧睾丸和附睾组织备用。 　　1.3 观察指标及测定方法 　　1.3.1 睾丸生殖细胞微核试验 采用辛华等[3]方法，取单侧睾丸置于洁净载玻片一端，剥除睾丸被膜，用眼科剪将曲细精管剪碎，其上滴2～3滴2.2%柠檬酸三钠，在玻片上与曲细精管充分混合，将玻片一端略微抬高，使细胞悬液与曲细精管分离，取适量细胞悬液推片， 自然 干燥，甲醇固定10min，晾干，室温下20%giemsa染色液(pH 6.8)染色15min，水洗后晾干，镜检。 　　1.3.2 睾丸及附睾重量的测定 处死动物，迅速取出睾丸和附睾，去除周围的脂肪组织和结蒂组织，用万分之一 电子 天平准确称量大鼠双侧睾丸和附睾的重量，并记录。 　　1.3.3 精子计数 按张军等[4]的方法，用血细胞计数板计数每克附睾中精子数。 　　1.3.4 精子活率的测定 取精子悬液1滴滴于载玻片上，观察精子活率，至少观察200个精子，分别计数有活动力及无活动力的精子数。 　　精子活率=活动精子数/(活动精子数+不活动精子数)×100%。 　　在室温20～22℃下，10min内结束整个操作和观察。 　　1.3.5 精子畸形率 参照张桥[5]的方法进行。 　　1.3.6 TUNEL法检测睾丸生殖细胞凋亡 操作过程按试剂盒说明书进行。凋亡细胞呈棕黄色，采用麦克奥迪公司医学图像分析软件对凋亡细胞的阳性表达进行定量分析。阳性目标平均灰度，其值的大小与阳性表达强度成正比。 　　由表1可见，辛硫磷和灭