提高PCR扩增大DNA片段的特异性和产量-遗传.PDFVIP

遗传 HEREDITAS(Beijing)18(5):46-481996 综 述 提高PCR扩增大DNA片段的特异性和产量 卢一凡 邓继先 肖成祖 马清钧 浑事医学科学院生物工程研究所，北京 100071) IncreasingSpecifityandYieldofPCRAmplificating LongDNAFragment LuYifan DengJixian XiaoChengzhu MaQingjun (InstituteofBiotechnology,AcademyofMilitaryMedicalScience,Beijing100071) 聚合酶链式反应(P（CR）技术虽仅产生数年，却以惊人的速度广泛应用于分子生物学各个领域．它能快速、特 异地扩增出任何所希望的目的基因或DNA片段，用于基因克隆、测序、突变体和重组体构建、基因表达调控的 研究、基因多态性分析、遗传病和传染病诊断、肿瘤机制的探查、法医鉴定等诸多方面．目前，PCR扩增DNA 片段长度可达到近50kb，这在生物学研究特别是在基因组图谱绘制和测序中将起到革命性作用 ’（，，，尽管PCR 技术有诸多优越性，但扩增大DNA片段却并非易事，特别是从复杂的基因组DNA作为模板更增加其难度．当前 利用PCR扩增大的DNA片段大多局限于3-4kb)，尽管已有一些扩增出较大的PCR产物的报道 9〔,15,16,20) 但对最佳扩增条件所做的探索性研究不多．也难以如标准PCR那样推出一些标准化的条件．本文根据现有文献 对一些影响扩增大DNA片段的因素加以分析，并提出了提高扩增特异性和产量的可能的途径。 1模板 在常规PCR中，对模板的要求并不严格。对不同来源的组织生物样品都已成功地进行了PCR．然而对于扩 增大片段DNA来说，情况却并非如此．首先是要求模板的完整性。许多研究都已证明，在扩增长度达10-15kb 时，质量完整的模板与之有很大关系．从复杂的基因组DNA片段来看，其片段的长度最小应在50kb，对其采用低 熔点琼脂糖回收可获得更为理想的扩增效果 l（8)．其次，对如此之大的DNA特别是复杂的基因组DNA模板进 行扩增，需要延长变性时间或使用较高的变性温度，以及提高有效引物退火的温度和时间，后者在未知模板长度和 序列特性 如（G+C含量）或存在有二级结构时尤为重要．在提高温度时，较大的DNA模板导致出现更多的对脱 嗦吟和脱氨基的敏感位点出现 7（-8)，因而有时导致PCR扩增失效，而在反应体系中加人甘油和二甲基亚枫可以 使变性温度有所降低，或缩短变性的时间，减少对模板的损害 幻〔．模板浓度直接影响扩增的重复性、特异性和扩 增的产量．过量的模板导致错配机率增高，从而非特异性增大．模板量太少，扩增高分子量、低拷贝数的PCR产 物，则重复性不佳，而且常常PCR产物的量不足以检测 ’‘”．许多研究者试验扩增0.1-IOOng的模 板1（,10,12,1E-17,20)，结果表明，对复杂基因组DNA扩增时，模板量至少要达到100ng水平9()。 2缓冲液体系 标准PCR使用的缓冲液含有 IOmmol/LTrisHCl(pH8.3-8.4,20-25IC)，它使PCR获得成功的原因是这 一体系致使反应达到最佳引物— 模板结合的体系。然而，在扩增大片段DNA时却并非最佳．Cheng等 1（994) 5期 卢一凡等：提高PCR扩增大DNA片段的特异性和产量 47 为确定扩增高分子量PCR产物的最佳缓冲液体系，将TrisHCl从 10mmol/L提高到25mmol/L，浓度提高 2.5倍，获得了较好的扩增结果．这表明，对于扩增较大DNA片段时，由于延伸时间的加大，也需要较大的缓冲能 力．在标准PCR中某些共溶剂的使用已能使扩增效果得以改善 ”〔〕，对于扩增大片段DNA也同样有效．在标准 rTaqPCR缓冲液中加入8％的甘油能使扩增达到10-19kb，甘油可以影响大片段扩增，主要是通过(1（)提高聚合 酶的热稳定性，如rTaq聚合酶在95-97.5℃时，在甘油存在下，稳定性可以提高两倍多；(2)有效地降低熔点和解 链温度每（10％甘油可以降低2.5-3r-)，这有助于变性模板和增大引物退火的特异性 (2（)．