第七章固定化酶、固定化细胞.pptVIP

第七章 酶与细胞的固定化 第一节 概 述 一、概念与特性 1.固定化酶：是被固定在某一有限空间内不再能自由流动而仍有催化活性的酶。 2.固定化酶的特性 ?优 点： a.不溶于水，易于与产物分离； b.可反复使用； c.可连续化生产； d.稳定性好。 ?缺 点：固定化过程中往往会引起酶的失活。 二、固定化酶的研究历史 1.18世纪初，就已有用木屑吸附微生物制醋的生产方法。 2.1916年Nelson和Griffin就已发现酵母的转化酶被骨碳粉末吸附后制成的固定化酶具有与液态酶同样的活性。 3.20世纪60年代，以色列Katzir Katchlski教授(前总统)开发了许多新的酶固定化方法，使研究日益增多。 4.1969年，千畑一郎成功地将固定化氨基酰化酶用于DL-氨基酸地光学拆分。1973年，其又成功地将固定化微生物用于工业化连续生产L-天冬氨酸。 5.美国Anfinsen和Cuatrecasas开创了亲和层析。 第二节 酶的固定化 一、制备固定化酶的依据 1.固定化酶必须能保持酶原有的专一性、高效催化能力和常温、常压下能起催化反应等特点； 2.固定化酶应能回收、贮藏，利于反复使用； 3.固定化酶应用于机械化和自动化操作，所用载体常有一定的机械强度； 4.固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性。即要保护活性中心基团； 5.固定化酶应能最大程度与底物接近，从而提高产量。具有最小的空间位阻； 6.固定化酶应有最大的稳定性； 7.固定化酶应易与产物分离。 二、固定化技术 1.吸附法 ①物理吸附 ②离子吸附 2.包埋法 ①格子型包埋 ②微胶囊型包埋 3.共价键结合法 ?重氮化法 ?烷基化法和芳基化法 ?戊二醛化法 4.交联法 （四）酶固定化方法 1.吸附法：酶被吸附于惰性的固相载体或离子交换剂。根据酶分子与载体吸附的性质有物理吸附和离子吸附两种。 ?物理吸附法：使用对酶蛋白有高度吸附能力的硅胶、活性炭，氧化铝、高岭土、石英砂、火棉胶、多孔玻璃、碳酸钙凝胶、纤维素、麸素等在一定条件下与水溶酶作用制得。 a.优点：操作简单，反应条件温和，酶活力损失少，载体可反复使用； b.缺点：易引起蛋白质表面变性，且由于结合力弱，当反应液的pH值、离子强度、温度、底物浓度等发生变化时，会导致酶易从载体上部分或全部脱落。 物理吸附法固定化酶举例 ?离子吸附法：利用含有离子交换基团的固相载体（如具有交换基团的葡聚糖凝胶或纤维素）与酶蛋白分子的带电基团互相吸引（靠离子链）而形成络合物。 a.优点：制作简单，处理条件缓和，酶蛋白的活性中心和高级结构破坏较少，可以制得活力较高的固定化酶。 b.缺点：离子键结合较松散，如在高离子强度下进行反应时，酶与载体易分开。 2.包埋法：将酶包埋在凝胶的微小空格内或埋于半透膜的微型胶束内，但底物仍能渗入到里面与酶接触。分为微胶囊包埋法和格胶包埋法。 a.优点：利用此法制得的固定化酶，由于酶分子仅仅是被包埋起来，而未受到化学作用。酶蛋白几乎不起变化，可适用与多种不溶酶的制备。 b.缺点：酶被包埋在内部，对大分子底物很难发生催化作用。一般只适用与小分子底物。 ?微胶囊包埋法：将酶包埋在半透性聚合体膜内，形成的直径为1－100um。如，天门冬酰胺酶采用此法包埋。 微型胶囊法形成的固定化酶 ?格胶包埋法：以丙烯酰胺、硅胶、淀粉琼脂等材料，在酶存在下聚合成凝胶，酶被包埋在聚合物的细小多孔的网状格子中。 3. 交联法：依靠双功能基团的试剂，使酶蛋白分子之间发生交联，凝集成网状结构而成为固定化酶，最常用的双功能试剂有戊二醛、异氰酸酯和双重氮联苯胺等。酶蛋白中的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。双功能试剂：常用的是戊二醛。 H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H ②共价偶连法的特点 a.优点：此法制得的固定化酶，酶分子和载体间的共价键较牢固，在介质组成发生改变和进行反应时，都不会造成酶的脱落，因而可以反复使用。 b.缺点：制取固定酶较复杂，反应条件比较剧烈，所以要制得酶活力很高的固定化酶较为困难。 ?共价偶连法的制作方法包括：有重氮化法、烷基化和芳基化法、肽法和戊二醛法等。 三、固定化酶应注意的几个问题 （一）酶活性的测定方法 1.测定酶的固定化量：固定化反应完成后，以原始酶量减去洗涤液（反应液）中残存的酶含量。 2.测定颗粒直径：固定化酶的粒径越小，酶活性越高。固定化酶颗粒直径大小影响酶活性。 3.测定酶反应最适pH值：酶固定化后反应的最适pH较原来的酶有所变化。 4.检查酶是否脱落：测定酶活性后，滤除固定化酶，用离心所得的溶液再经过适当保温检查是否还继续进行反应，如果溶液中出现酶反应，说明酶脱落。 （二）制备过程中保持酶活性稳定的方法 1.酶活性中心的保护方法：