转透明颤菌血红蛋白基因黄芪毛状根急性毒性探究.doc

转透明颤菌血红蛋白基因黄芪毛状根急性毒性探究摘要：目的初步评价转透明颤菌血红蛋白基因(vgb)黄芪毛状根的安全性。方法对非转基因黄芪毛状根、转vgb黄芪毛状根及黄芪药材进行急性毒性试验。结果ig转vgb黄芪毛状根的LDso为59.58 g／kg体重，95％可信限为55.97～63.39 g／kg体重，平均可信限为59.58±3.71 g／kg体重。结论急性毒性实验表明，黄芪甲苷用量相同条件下，转基因黄芪毛状根符合安全用药的规定。 关键词：黄芪；透明颤菌血红蛋白；转基因；毒性 中图分类号：11282.71 文献标识码：A 文章编号：1672-979X(2010)09-0315-03 黄芪为豆科植物膜荚黄芪Aastragalus membranaceus(Fisch.)Bge.及其变种蒙古黄芪，4asWagalus membranaceus(Fisch.)Bge.vat mongholicus(Bgc.)Hsiao的干燥根，是我国重要的传统中药材之一，近年需求逐年增加，野生资源逐年减少，栽培品品质下降。为解决资源问题急需寻求新的途径。 由于毛状根具有生长速度快、遗传性稳定等特点，近年已成为生产中药材的重要生物反应器。但是，培养过程中低溶氧成为大规模培养毛状根的重要制约因素，如何提高毛状根的溶氧含量或氧的利用率极为迫切。透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla Haemoglobin，VHb)是由专性好氧菌透明颤菌属(Vitreoscilla sp)在贫氧条件下产生的一种可溶性血红蛋白，与增加供氧有关。将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)转入黄芪毛状根，结果显示，转vgb黄芪毛状根生长速度快，黄芪甲苷含量明显增加。薄层色谱检测表明，转vgb黄芪毛状根化学成分和黄芪药材基本相同，但转vgb黄芪毛状根能否替代黄芪药材尚需药理实验的多方面验证。为保证用药安全，我们研究了转vgb黄芪毛状根的急性毒性，并与非转基因黄芪毛状根、山西产和崇明产膜荚黄芪作了比较。 1材料 1.1实验材料 1.1.1非转基因及转vgb黄芪毛状根水煎液制备利用培养系统培养的非转基因黄芪毛状根及转vgb黄芪毛状根，冷冻干燥后制成干粉，各取300 g，加10倍体积蒸馏水浸泡2 h，微火煮沸30 min，4层纱布过滤，再加6倍体积蒸馏水微火煮沸30 min，过滤后合并滤液，3 000 r／min离心15 min，合并上清液，浓缩至药液浓度为非转基因黄芪毛状根3.16 g／mL，转vgb黄芪毛状根2.76 g／mL。 1.1.2黄芪药材水煎液制备山西产和崇明产膜荚黄芪药材的干燥根粉碎成细粉。制备方法与制备非转基因黄芪毛状根相同，分别浓缩至3.21 g／mL和2.08 eCmL。 1.2实验动物 昆明种小鼠，清洁级，由上海中医药大学实验动物中心提供。体重18～22 g，雌雄各半。 2方法 取小鼠雌雄各半，禁食不禁水12 h后，随机按体重分组，每组10只，分别ig非转基因黄芪毛状根59.0，65.7，73.0，81.0，90.0／kg，转vgb黄芪毛状根46.3，51.4，57.0，63.5，70.5 g／kg，山西产黄芪128.4 g／kg，崇明产黄芪83.2 g／kg。观察小鼠死亡情况，连续7 d记录症状，7 d后再次称体重。按孙氏综合法(改进寇式法)计算LDso值及95％可信限和平均可信限。 3结果 ig非转基因黄芪毛状根，在65.7，73.0，81.0，90.0 g／kg组及ig转vgb黄芪毛状根51.4，57.0，63.5，70.5 g／kg组，部分或全部小鼠在30 min左右开始出现身体发抖、摇晃、呼吸急促，持续约30 min自发动作迟缓，四肢松软，产生剧烈抽搐、惊厥直至死亡，解剖后未见小鼠内脏异常病变。非转基因黄芪毛状根及转vgb黄芪毛状根小鼠死亡率随用药量增加而增加，结果见表1、表2。而ig给予山西产黄芪128.4 gg和崇明产黄芪83.2 g／kg均未出现毒性反应。根据孙氏综合法计算得ig非转基因黄芪毛状根的LI)50为72.9 1 g／kg体重，95％可信限为65.4～81.28 g／kg体重，平均可信限为72.91+7.94 g／kg体重，与1999年本室的黄芪毛状根急性毒性实验结果相符。ig转vgb黄芪毛状根的LDso为59.58 g／kg体重，95％可信限为55.97～63.39 g／kg体重，平均可信限为59.58+3.7l g／kg体重。 4讨论 一般认为，对转基因作物生物安全性的考虑主要包括两方面。一是转基因植物环境释放或商业化使用带来的环境安全问题，主要有杂草化、基因漂移、抗病虫转基因植物对非靶标的影响及抗病毒转基因植物对环境的影响等；二是转