辛伐他汀对缺血再灌损伤心肌细胞凋亡及bcl-2-bax基因蛋白影响.docVIP

辛伐他汀对缺血再灌损伤心肌细胞凋亡及bcl-2/bax基因蛋白影响摘 要 目的：辛伐他汀对缺血再灌心肌细胞凋亡及bcl-2/bax基因蛋白的影响。方法：20只大白兔随机分为2组，辛伐他汀治疗组(灌服辛伐他汀15mg/kg，每日1次，共7天)及对照组(灌服等量生理盐水，每日1次，共7天)；采用结扎左冠状动脉前降支30分钟后再灌注120分钟制备心肌缺血再灌模型；实验结束前取心脏标本，进行细胞凋亡TUNEL法检测以及免疫组化检测心肌组织中bcl-2、bax蛋白水平。结果：①治疗组心肌细胞凋亡指数(AI)明显低于对照组(P0.05)；②治疗组心肌组织bcl-2蛋白明显高于对照组(P0.05)，bax蛋白明显低于对照组(P0.05)。结论：辛伐他汀可抑制细胞凋亡，减轻心肌损伤，其抑制凋亡可能是通过上调bcl-2蛋白表达和下调bax蛋白表达来实现的。 关键词 辛伐他汀 心肌缺血再灌注 细胞凋亡 资料与方法 主要试剂和动物分组：TUNEL试剂盒购自美国、Ⅱ型胶原酶购自美国、bcl-2和bax试剂盒购自美国、辛伐他汀购自杭州。健康中国家兔20只，雌雄不限，单体质量(2.53±0.26)kg，随机化分为治疗组和对照组(每组10只)。治疗组给予辛伐他汀15mg/kg，对照组予等量盐水，术前7天灌服，每日1次，连续7天。 模型制备：所有大白兔均用1％戊巴比妥钠30mg／kg静脉麻醉，气管插管，辅助通气，用肝素充盈的普通胶管做右颈总动脉插管，经Mpa-0.5A换能器连接二道生理记录仪（LMB-2B型，成都仪器厂）监测血压，并以肢体I导联同步监测心电图。左侧开胸，暴露心脏，切开心包，自冠状动脉前降支（LAD）起点0.5cm处穿线（3～0丝线）环绕动脉。结扎线自一胶管腔内引出，结扎LAD，通过肉眼观察及心电图改变，判断LAD结扎是否成功。LAD结扎30分钟后松开，再灌注2小时。LAD结扎成功标准[2]：心电图显示ST段抬高、QRS波变高变宽和缺血心肌变为青紫色。LAD再通成功标准：解开结扎线后QRS波幅逐渐回落、抬高的ST段回落和缺血区心肌变红。 心肌组织切片制备：实验结束后，将大白兔处死，取出心脏，用0.85%氯化钠液冲洗，10%甲醛固定24小时。常规石蜡包埋，于心肌梗死区中部沿左室轴线每隔1mm连续切取数个5μm厚的切片，分别作苏木精伊红染色，并行细胞凋亡及bcl-2、bax基因蛋白表达检测。 TUNEL法原位检测心肌细胞凋亡：用PBS液作空白对照，用非免疫血清作阴性对照，具体操作步骤及结果检测按试剂盒说明书进行。凋亡细胞半定量分析：在400倍高倍视野下，每张切片计数5个高倍视野，分别计算每个视野细胞核数及凋亡阳性细胞核数，取均值，根据Naru-la方法计算出凋亡指数(AI)：AI(%)=凋亡阳性的细胞核数/总计数的细胞核×100%。 免疫组化检测心肌组织中bcl-2、bax蛋白表达:组织块经10%多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋，5μm厚连续切片，二甲苯脱蜡及梯度乙醇脱水后，按说明书操作，用SABC免疫组化法检测bcl-2、bax蛋白的表达。光镜下见阳性细胞质呈黄色或黄棕色，每个样本随机选10个视野作图像分析，并用阳性积分光密度值/管壁面积计算统计值。阴性对照用PBS液代替抗bcl-2、bax抗体。 统计学分析所有的数据以均数±标准差（X±S）表示，采用11.5SPSS统计软件，用t检验，P0.05差异有统计学意义。 结 果 TUNEL染色：光镜下凋亡的心肌细胞细胞核为深浅不一的棕褐色，细胞轮廓清楚;正常细胞核呈蓝色，坏死区细胞结构模糊不清。TUNEL阳性细胞计数结果为：细胞凋亡指数(AI)在对照组为13.3863%±0.6426％，而治疗组为5.2453%±0.5732％、两组比较有统计学意义(P0.05)。 免疫组化凋亡相关基因bcl-2、bax蛋白表达:与对照组比较，治疗组心肌细胞bax蛋白表达光密度值明显下降(P0.05)，bcl-2蛋白表达光密度值明显增高(P0.05)(见表)。 讨 论 他汀类药物是近十几年开发的三羟基三甲基戊二酰辅酶A(HMGCoA)还原酶抑制剂，多项大型临床实验已证实其对冠心病有一级和二级预防作用。大量证据表明，近年来，许多研究表明他汀类药物在与降脂作用无关的情况下，不仅能减少缺血损伤，保护脏器功能，而且能通过改善内皮功能、抗炎、抑制血栓形成等途径对心肌缺血再灌注损伤起到保护作用[1～3]。 从我们的实验结果可以看出，辛伐他汀可以通过促进bcl-2基因的表达、减少bax基因表达来抑制心肌缺血再灌注所导致的心肌细胞的凋亡，进而减轻冠状动脉粥样硬化性心脏病、心肌梗死、心肌缺血再灌注等情况下的心肌损伤。 由此可见，辛伐他汀对心肌缺血