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辣根过氧化物酶逆行示踪实验探究[摘要]目的建立神经逆行示踪的动物模型。方法将辣根过氧化物酶经大鼠右侧肱二头肌注入，两天后取材进行组织化学反应。结论辣根过氧化物酶可作为一种神经逆行示踪的方法。 [关键词]辣根过氧化物酶; 神经示踪 [中图分类号] R392[文献标识码]A [文章编号] 1005-0515（2010）-10-001-01 THE ANIMAL MODEL OF HORSERADIS PEROXIDASE NERVE RETROGRADE TRACT-TRACING LIUMingzhong，ZHANGWenming SHIJianhui,LUTianxiang,WUShanpeng. (Department of Orthopedics,the First Hospital of Quanzhou，Quanzhou Fujian，362100，P．R．China； Department of Orthopedics,the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,fuzhou Fujian, 350005) [Abstract]ObjectiveTo establish the animal model of nerve retrograde tract-tracing.MethodsHorseradis peroxidase is injected to the rat through the right bicipital muscle,then take the material to conduct histochemical reaction after two weeks.Conclusion Horseradis peroxidase can be used to the nerve retrograde tract-tracing. [Keywords] Horseradis peroxidase;nerve retrograde tract-tracing 辣根过氧化物酶（HRP）是一种含血红素基的植物糖蛋白，肌肉内注射可由肌肉神经末梢吸收，逆向运至胞体，到达一定部位后可以用组织化学的方法显示出来。1971年Krisenson等及1972年Lavail等先后将HRP用于追踪周围神经及中枢神经的纤维联系，创造了HRP追踪技术。本文在参考前人经验的基础上，综合文献，重建神经逆行示踪的动物模型。 1 实验设计 1.1 实验动物 动物选用健康成年清洁级SD大鼠20只(由福建医科大学实验动物中心提供)，体重200～250g，雌雄不拘，行经右侧肱二头肌注入辣根过氧化物酶。 1.2 仪器显微镜显微外科手术器械电子天平 1.3试剂肝素钠生理盐水（0.25mg/100ml），1%多聚甲醛-1.25%戊二醛的0.1mol/l磷酸盐缓冲液(PH7.4)， 10%蔗糖， HRP 粉剂（厦门星隆达公司提供），四甲基联苯胺（TMB），无水乙醇，钼酸铵，硝普钠，0.1mol/l 醋酸盐缓冲液（pH3.7 ），30% 双氧水（H2O2） 2 实验步骤 2.1 动物模型的建立大鼠以2％的氯胺酮（80-100 mg/公斤体重）腹腔注射麻醉，备皮，仰卧固定于手术台上，术野消毒，在16倍手术显微镜下操作，沿右锁骨下做2-3cm横切口，分离切开皮肤，皮下组织，沿胸大肌?胸小肌的肌纤维走向钝性分离，用自制的小拉钩分别向上、下牵开肌肉,显露暴露肱二头肌（见图1），电子天平称其30mgHRP 粉溶于0.1ml蒸馏水中，暴露肱二头肌，注入30%HRP溶剂5μl，关闭切口。存活48小时。 图1 2.2 灌注固定 动物麻醉同前，开胸，经左心室-主动脉插管，灌注温的（37℃）肝素钠生理盐水，冲洗血液至液体清亮，约100 ml，同时切开右心房放血。 再灌注冷的固定液（1%多聚甲醛-1.25%戊二醛的0.1mol/l磷酸盐缓冲液，PH7.4， 4℃），约500ml ,30分钟。灌注后用含10%蔗糖的0.1mol/l磷酸盐缓冲液100ml冲洗总时间亦为30min。 2.3取材随后在放大16倍手术显微镜下，将大鼠C6节段脊髓取出（见图2），组织块放入含25%蔗糖的0.1mol/l磷酸盐缓冲液于4℃冰箱过夜。 图2 2.4 切片 待脊髓在蔗糖液中沉底后，标本以磷酸缓冲液略洗，冷冻切片机冠状切脊髓，厚15－20um，贴于多聚赖氨酸载玻片上，回至室温凉干或烘干 。 2.5 呈色反应 2.5.1 组织片用双蒸水冲洗后在孵育液中避光预反应20min。（孵育液由A液和B液