黄芩苷及川芎对UVB辐射皮肤成纤维细胞影响.docVIP

黄芩苷及川芎对UVB辐射皮肤成纤维细胞影响[摘要]目的：研究中药活性成分黄芩苷，川芎对中波紫外线(UVB)辐射损伤成纤维细胞保护作用的影响及相关作用机制。方法：采用0mJ/cm2，30mJ/cm2，60mJ/cm2，90mJ/cm2剂量UVB照射培养的原代人皮肤成纤维细胞，同时加入黄芩苷和川芎干预处理，观察细胞损伤的形态学变化，以MTT法检测细胞活性，以酶联免疫吸附实验(ELISA)检测IL－10，IL－12和TNF－a的分泌量。结果：UVB照射后，细胞损伤程度与照射剂量呈正相关，增殖活性下降；此外，UVB照射后IL－10等细胞因子分泌增加，而加入所试中药干预可明显抑制细胞损伤和相关细胞因子分泌。结论：黄芩苷、川芎有一定的光保护作用，抑制炎症细胞因子IL－10，IL－12，TNF－a的分泌可能是其减轻UVB光损伤的机制之一。 [关键词]紫外线；成纤维细胞；黄芩苷；川芎；IL－10；IL－12；TNF－a；光损伤；光保护 [中图分类号]Q256　[文献标识码]A　[文章编号]　1008－6455(2007)07－0977－03 紫外线的辐射(包括UVA，UVB)是导致人体皮肤日晒伤、光老化及皮肤癌的主要因素。高紫外线暴露人群皮肤老化危险性比低暴露人群高一倍，老化发生提前10年。皮肤光老化不仅有损于人的美容，而且与皮肤病的发生有着病因学的联系。中波紫外线(UVB)辐射可引起皮肤老化的发生，外观出现干燥，粗糙，失去弹性，产生皱纹，皮肤的弹性蛋门和胶原蛋白的含量出现变化。成纤维细胞是UVB敏感的靶细胞，经UVB辐射后，可以释放一些具有免疫调节作用的细胞因子，引发一系列的信号传导，最终可以导致皮肤老化的发生。 IL－10，IL－12，TNF－a均是由皮肤成纤维细胞合成的土要细胞因子，参与紫外线引起的皮肤炎症反应过程及免疫调节，并在紫外线介导的细胞凋亡中起着重要作用。传统中药黄芩中的活性成分黄芩苷，及川芎等可抑制紫外线照射所致的皮肤脂质过氧化，防治皮肤的光损伤。本文通过体外培养人原代表皮成纤维细胞，用一定剂量的UVB照射，并分别以所选中药处理，旨在证实所选药物可缓解UVB照射的损伤作用。 1　材料和方法 1．1　材料：健康青少年男性包皮环切术切除的包皮，生理盐水，0.5％的中性蛋白酶(sigma公司)，表皮消化液(0.25％的胰蛋白酶和0.1％的EDTA，Amresco公司)，DS培养基(DMEM加10％小牛血清，GIBCO公司)，四甲基偶氮唑(sigma公司)，黄芩苷(中国药品检验所)，川芎(中国药品检验所)，96孔培养板。 1．2　方法 1．2．1　原生代成纤维细胞培养：将包皮剪成0.5cm×0.5cm的皮片，碘伏浸泡5min后用含青霉素(10万u/L)和链霉素(100mg/L)的生理盐水漂洗3次，加入0.5％中性蛋白酶，在4℃下消化18－20h，将皮片的真、表皮进行分离，真皮部分以表皮消化液在37℃下消化5min后，加入DS培养基，轻轻吹打，200目尼龙网过虑，过滤后的细胞液1500r/min离心5min，弃去上清，加入DS培养基继续培养。 以0.25％胰酶和0.02％EDTA消化上述细胞，调整其密度为1×106/ml定量接种于96孔板，培养24h，待其贴壁后用于细胞活性检测和细胞因子水平检测。 1．2．2　实验分组：实验分为量效组和加药组，每组均设OmJ/cm2为对照组，量效组接受30mJ/cm2，60mJ/cm2，90mJ/cm2UVB照射后孵育24h，加药组加入黄芩苷、川芎预处理后，接受30mJ/cm2，60mJ/cm2及90mJ/cm2 UVB辐射孵育24h，根据预试验结果选用黄芩苷浓度为15μg/ml，川芎浓度为50μg/ml。 1．2．3　紫外线照射：接种于培养板中的细胞生长至70％融合时给予UVB照射，照射前先弃去各孔细胞培养液，PBS洗二遍后加少量PBS覆盖底面，置紫外线辐射仪(上海sigma技术有限公司生产，发射峰310nm)照射，细胞与灯管距离15cm，然后弃覆盖液换回DMEM培养基。 1．2．4　四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性：照射细胞后24h向每100μl培养基中加入20μl浓度为5mg/ml的MTT，孵育4h后弃上清，加入120μl二甲基亚砜(DMSO)，室温震荡15min，用128c酶标仪(奥地利CliniBio公司)在570nm波长处测吸光度OD值，空白试剂孔调零，读取吸光度值。 1．2．5　酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞因子分泌量：上述细胞照射后24h收集细胞培养上清液，冻存于－70℃冰箱。使用ELISA试剂盒(BPBBiomedical，Inc)严格按说明书操作。简要步骤：离心检测标本取上清和标准品一起