杜氏盐藻rbcS启动子的克隆和功能分析.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（４）：４７～５２ 杜氏盐藻ｒｂｃＳ启动子的克隆和功能分析 １，２ １ １ １ １ 柴玉荣 　田　芳 　刘红涛 　李　杰 　薛乐勋 （１郑州大学细胞生物学研究室　郑州　４５００５２　２郑州大学基础医学院组胚教研室　郑州　４５００５２） 摘要　为提高转基因盐藻的表达效率，利用基因组步行方法和巢式ＰＣＲ，从盐藻中克隆了１，５二 磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶（ｒｕｂｉｓｃｏ）的小亚基基因ｒｂｃＳ的５′上游调控序列，并对其进行序列分析 和转基因功能分析。采用ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩ和ＳｔｕＩ４种平端限制内切酶分别酶切盐藻基因组 ＤＮＡ，并与接头连接，构建基因组步行文库ＧＷＬ１、ＧＷＬ２、ＧＷＬ３和ＧＷＬ４；设计特异引物从这４ 种文库中扩增ｒｂｃＳ基因的５′上游调控序列。在 ＧＷＬ１、ＧＷＬ４中分别扩增出约１．２ｋｂ的片段。 对该序列的分析表明，它的３′端与已知盐藻ｒｂｃＳｃＤＮＡ的５′端序列完全一致，说明是该基因的５′ 端上游区，并且包含多个与转录调控有关的保守序列（如ＴＡＴＡｂｏｘ，ＣＡＡＴｂｏｘ），富含 ＧＴ的重复 序列。此序列ＥｃｏＲＩ下游的片段与除草剂抗性基因ｂａｒ相融合，构建表达载体，电击法转化盐藻。 通过对转化藻株的抗性筛选以及ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测，表明该区域能驱动外源基因ｂａｒ在转 基因盐藻中的表达，推断是盐藻ｒｂｃＳ基因的启动子调控区。 关键词　盐藻　１，５二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶　ｒｂｃＳ　启动子 中图分类号　Ｑ７８６ 　　杜氏盐藻（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａｓａｌｉｎａ，简称盐藻）是一种极 的功能［３］。ＲｕＢｉｓＣＯ也是植物可溶性蛋白中含量最高 其独特的单细胞真核绿藻，能在０．０５～５ｍｏｌ／Ｌ的盐水 的一种蛋白质，约占５０％左右。在转基因研究中，作 ［１］ 为一种光诱导表达的启动子，ＲｕＢｉｓＣＯ的小亚基 ｒｂｃＳ 中正常生长、繁殖 。它的突出优点在于光合自养，抗 ［４，５］ 逆性强，培养条件简单；没有细胞壁，利于遗传转化操 的启动子经证实是一种高效表达的调控元件 。为 作；属于真核生物，具有自主转录和翻译后的加工能 此，我们采用基因组步行方法克隆了来自盐藻自身ｒｂｃＳ 力，能生产高活性的功能蛋白；富含胡萝 卜素和甘油， 基因的启动子，并以来源于Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃａｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ编 本身无毒无害，营养价值高，可直接作为天然保健食 码草丁膦乙酰转移酶的ｂａｒ基因作为筛选标记基因，对 品，因此用它作为生物反应器生产口服型疫苗或其他 其功能进行了转基因盐藻分析，这盐藻生物反应器的 蛋白，可以无须纯化即可直接服用，大大降低生产成 建立奠定了一定的实验基础。 ［２］ 本 。转基因盐藻研究的关键是获得高效的表达调控 １　材料与方法 元件，提高外源基因在盐藻中的表达，以此来优化生物 反应器。 １．１　材　料 　　１，５二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶（ｒｉｂｕｌｏｓｅ１，５ １．１．１　藻株和培养　杜氏盐藻（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａｓａｌｉｎａ ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ／ｏｘｙｇｅｎａｓｅ，Ｅ．Ｃ．４．１．１．３９，简 ＵＴＥＸ１６４４Ｔｅｏｄ）购自美国德州大学。盐藻的培养：按 ５ 称ＲｕＢｉｓＣＯ）是光合作用中的关键酶，催化羧化反应和 照５×１０细胞／ｍｌ的接种量接种于改良的ＢｅｎＡｍｏｔｚ 氧合反应，由８个大亚基（ｒｂｃＬ）和８个小亚基（ｒｂｃＳ）组 液体培养基，于２