羊栖菜多糖(SPFS-B1)原子力显微镜观察.docVIP

羊栖菜多糖(SPFS-B1)原子力显微镜观察（1.哈尔滨商业大学 生命科学与环境科学研究中心，黑龙江 哈尔滨 150076；? 2.国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，黑龙江 哈尔滨 150076）?? 摘 要：将提取的羊栖菜多糖Sevage法除蛋白、H?2O?2脱色后得到羊栖菜多糖半纯品，依次通过DEAE-52、Sephadex G-200柱层析分离纯化后得到SFPS-B1。用原子力显微镜（AFM）对羊栖菜多糖（SPFS-B1）的微观结构进行观察。羊栖菜多糖（SPFS-B1）分子的稀溶液铺展在新鲜解理Ni??2＋?处理的云母片上，经干燥，乙醇固定后，获得稳定、重复的图像。羊栖菜多糖（SPFS-B1）分子具有高度分枝的结构，并且糖链间形成环状、柱状或近似于螺旋状的结构。羊栖菜多糖（SPFS-B1）链呈多股紧密的螺旋结构，这种现象可能与该多糖中分子间的Van der Waals相互作用以及糖链间氢键缔合有关。? 关键词：原子力显微镜；羊栖菜多糖；螺旋结构? 中图分类号：R915；R917文献标识码：A文章编号：1673-2197（2008）10-0012-02 生命中的螺旋结构现象可能具有普遍性，除蛋白质、核酸、脂类等生物分子都存在螺旋结构外［1，2］，多糖的螺旋状结构也有报道［3，4］，但羊栖菜多糖是否也存在螺旋状结构至今尚未见报道。由于多糖相对分子质量较大，结构复杂，自身常存在结构缺陷，从而难以得到良好的晶形，原子力显微镜（?Atomic Force Microscope，AFM）的出现，使得对多糖这样的生物大分子表面形貌的观察成为可能［5，6］。我们用AFM直接观察羊栖菜多糖的微观结构，获得了较清晰、重复性好的分子链结构影像，这为深入研究生物组织的微观结构和揭示生命规律，提供了重要依据。? 1 材料与方法? 1.1 材料与仪器? DEAE-52（Pharmacia），Sephadex G-200（Pharmacia），羊栖菜购自哈尔滨市药材公司，并经哈尔滨师范大学生物系鉴定。? Adventurer万分之一电子天平（OHAUS公司），旋涡混合器（美国BohemiaNY公司），AJ-Ⅲ型原子力显微镜（爱建纳米）。? 1.2 羊栖菜多糖的分离纯化? 取一定量的羊栖菜多糖配制成一定质量浓度的多糖水溶液，加入氯仿、正丁醇（5：1），剧烈震荡20min，混匀，离心（10min，3000r）。除去水相与有机相间的蛋白，水相仍按照此方法反复除蛋白6次后，氨水调节pH值8~9，加入10%左右的H?2O?2放入冰箱保鲜层过夜，流水透析72h，蒸馏水透析24h，减压浓缩后，加入4倍体积的无水乙醇，充分震摇于4℃静置24h，弃上清，沉淀以无水乙醇、丙酮洗涤，备用。? 1.3 DEAE-52纤维素柱层析? 所得羊栖菜多糖进行DEAE-52（2.6×55cm）柱层析，用0.05mol/LNaCl洗脱，自动部分收集器收集洗脱液，苯酚硫酸法隔管检测，流水透析至无Cl-后，冷冻干燥得SFPS-B。? 1.4 Sephadex G-200凝胶过滤柱层析? 取SFPS-B分别溶于少量水中，进行Sephadex G-200（1.6×80cm）柱层析，以0.02mol/L的NaCl洗脱，自动部分收集器收集洗脱液，苯酚硫酸法隔管检测，合并单一峰，分别得到SPFS-B1、SFPS-B2部分。将SFPS-B1、SFPS-B2流水透析至无Cl-后冷冻干燥。得洗脱部分SFPS-B1，本研究对SFPS-B1进行AFM观察。? 1.5 AFM制样? 把SFPS-B1（1mg/mL）溶于去离子蒸馏水中，冷至室温，再稀释，加热溶解，冷却，直至样品浓度为0.01mg/mL。通过加热使样品溶解完全且减少大聚集体的存在，取5μL多糖溶液（0.01mg/mL）滴在新鲜解理的云母片上，空气中干燥10min，大量水冲洗去没有吸附的残留物，再滴加无水乙醇固定，为防止多糖从云母表面脱附，样片干燥后即可进行AFM测量。? 2 实验结果? 2.1 栖菜多糖DEAE-52? 纤维素柱层析如图1所示，样品洗脱峰为单一对称峰，流水透析至无Cl-后，冷冻干燥得SFPS-B。? 图1 NaCl洗脱曲线 2.2 羊栖菜多糖SPFS-B Sephadex G-200凝胶过滤柱层析? 如图2所示，洗脱组分为2个，将SFPS-B1、SFPS-B2流水透析至无Cl-后冷冻干燥。取洗脱部分SFPS-B1，本研究对SFPS-B1进行AFM观察。? 图2 SFPS-B Sephadex G200凝胶色谱纯化 2.3 羊栖菜多糖SPFS-B1的原子力显微镜（AFM）图?