皖南黑猪H—FABP基因5amp;#39;—上游区及第二内含子多态性策略.docVIP

皖南黑猪H—FABP基因5amp;#39;—上游区及第二内含子多态性策略 　　肌内脂肪（Intramuscular fat，简称IMF）含量，与肉质成正相关，影响肉质的风味、多汁性和嫩度，特别是嫩度。该性状属于数量性状，遗传基础受多基因控制，存在主基因效应[1]。常规育种技术在提高瘦肉率和生长速度等方面的同时，伴随着脂肪的减少，而且沉积在肌肉内的脂肪也同时减少，从而导致猪肉品质下降。一般认为2%～3%的IMF含量可产生理想的口感，但目前对瘦肉率的选择已经使猪肉中平均IMF含量下降至1%～1.5%，低于理想的范围[2]。据报道，IMF含量具有较高的遗传力（0.6），而与背膘厚间存在中等偏低的不利遗传相关（0.3）[3-4]。因此，可以对IMF含量进行遗传改良，进而有效地改善猪肉品质。心脏脂肪酸结合蛋白（Heart fatty acid-binding protein， H-FABP）是FABP家族的一员，是一种低分子量（15 Kda）的胞浆蛋白，由H-FABP基因编码，参与细胞内脂肪酸的运输，主要功能是将脂肪酸从细胞膜运送到beta;-氧化和三酰甘油及磷脂合成部位[5]。H-FABP在胞内与脂肪酸结合，使细胞内外脂肪酸保持一定的浓度差，促进脂肪酸的摄取，进而影响脂肪的沉积[6]。Gerbens等[7-10]通过与人类H-FABP cDNA 噬菌斑杂交分离出含猪H-FABP 基因的lambda;噬菌体，确定猪H-FABP基因的结构特征并将其定位在猪6号染色体SW316-S0003（16.6 cM）之间，该基因由1.6 kb的上游调控区域、0.2 kb的3-端非转录区、4个外显子和3个内含子组成。其中4个外显子分别编码24，58，34，17个氨基酸，3个内含子的大小分别为4.2，2.5，1.5 kb，该基因主要在心肌、骨骼肌和乳腺中表达[11]。Gerbens研究发现，H-FABP基因在杜洛克猪中存在HinfⅠ、HaeⅢ、MspⅠ3个酶切多态位点，并认为H-FABP基因多态性可作为IMF含量的侯选基因。随后又以153头梅山猪的杂交后代作为供试群体，测定了H-FABP基因的多态性、mRNA、蛋白质的表达水平和背最长肌上的IMF含量。结果表明，在HaeⅢ多态位点基因型之间，IMF含量的遗传变异与蛋白质的表达水平无关，而在mRNA水平上存在着显著的差异，H-FABP基因的mRNA与IMF含量显著相关。鉴于前人的研究结果，本试验选取IMF含量较高的安徽省地方优良品种猪即皖南黑猪为试验群体，采用PCR-RFLP方法检测皖南黑猪H-FABP基因5-上游区和第二内含子区不同位点的多态性及检测突变位点的基因型，并对该基因的多态片段进行克隆和测序分析。通过对皖南黑猪H-FABP基因5-上游区和第二内含子区变异位点的确切位置及引起变异的原因分析，旨在为继续研究该基因的不同区域以确定影响IMF沉积的主效基因，及为皖南黑猪的种质资源特性与MAS研究奠定理论基础。 　1 材料和方法 　1.1 试验材料 　1.1.1 耳样 试验猪为184头（均来安徽丰润生态农业开发有限公司），用耳号钳剪一小块耳组织（约0.5 g），放入盛有1 mL 70%乙醇的1.5 mL Ep管中，采集的样品-20 ℃保存。 　1.1.2 试剂 蛋白酶K、Premix Tag （Version 2.0）购自大连宝生物工程（大连）有限公司，内切酶HinfⅠ、HaeⅢ和MspⅠ购自上海捷瑞生物工程有限公司。 　1.2 试验方法 　1.2.1 DNA提取 参照文献[12]按常规方法进行基因组DNA的提取，将干燥后的DNA溶于100 mu;L的TE中，并用0.8%的琼脂糖凝胶电泳法检测提取物的质量。 　1.2.2 引物设计与PCR扩增 根据GenBank上注册的X98558、Y16180序列，在5-上游区和第二内含子区用Primer 5.0设计2对引物。引物序列见表1，该引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 　PCR扩增体系组分（25 mu;L）：其中Premix Tag （Version 2.0）12.5 mu;L，模板DNA 2 mu;L，上下引物（20 mu;Mu;）各1 mu;L，灭菌蒸馏水8.5 mu;L。 　PCR扩增条件：预变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 45 s，退火60 ℃45 s，延伸72 ℃2 min，共33个循环；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。 　1.2.3 PCR扩增产物的酶切 以HinfⅠ酶切PCR1扩增产物，以HinfⅠ、HaeⅢ、MspⅠ分别酶切PCR2的扩增产物。酶切体系20 mu;L，其中，PCR产物6 mu;L，10times;Buffer 2 mu;L，限制性内切酶1 mu;L，37 ℃反应4 h，酶切产物