ALK3基因对胚眼视网膜及晶状体相互诱导作用的影响及机制研究.pdfVIP

·中文论著摘要· ALK3基因对胚眼视网膜与晶状体相互诱导作用的影 响及机制研究 目的 提高人口质量，避免缺陷患儿出生，治疗先天性疾病已成为国人关注的焦点。 分子遗传学一基因组学的迅速发展，促进了分子医学时代的到来，推动了多种复 杂疾病致病基因的发现及其发病分子机理的认识。对于绝大多数遗传性眼病，目 前临床上尚无真正有效可以逆转或者延缓其发生的治疗手段，尽管先天性白内障 可以通过及早手术治疗使白内障盲得到不同程度的恢复，但由于婴幼儿视觉系统 的特殊性，如眼球仍在发育，屈光状态不稳定，术后炎症反应重等，都大大增加 了手术的风险和难度，另外术后弱视的治疗及对患儿的护理水平都与预后密切相 关，就我国而言目前先天性白内障术后的复明率及脱残率并不容乐观，而且即使 患儿可以获得高质量的手术，但是随之而带来的国家及家庭的财政支出极为庞大。 由于目前对于绝大多数遗传性眼病尚无有效治疗方法，多以保守治疗、药物治疗 并附以手术治疗为主，这不仅给患者及其家庭带来沉重的经济和精神负担，也无 法采取有效的遗传干预杜绝疾病对后代的威胁。因此阐释遗传性眼病的发病机制 非常重要，这对于在一定程度上预防或者延缓其发展具有重大而深远的意义。本 课题通过对ALK3基因在晶体内条件敲除小鼠的研究从蛋白及分子生物学水平对 胚胎发育过程中，ALK3对视网膜与晶状体之间相互诱导作用的影响及机制做深 入的阐述。 材料和方法 脊椎动物眼的发育需要晶状体和视网膜组织之间的相互诱导作用，这种相互 诱导作用需要一定的信号传导途径，在胚胎发育过程中，Alk3是BMP信号转导通 路上重要的受体，它的缺失可以导致眼部发育的异常，探讨它在晶体区的条件缺 失对晶体的发育产生的诱导作用以及对视网膜组织的发育产生的影响。通过这些 观察对胚胎发育过程中晶状体和视网膜组织之间相互诱导作用的机制做进一步的 阐述。本实验采用Alk3受体在晶体内条件敲除的小鼠，Alk3fl／fl；LeCre， alk3fl／+；或者母鼠alk3fl／+配公 砧k3fl／+；LeCre。母鼠alk3fl／fl配公鼠lecre alk3fl／+。 鼠lecrealk3伽，产生实验组：50％lecrealk3fl／fl，对照组：50％lecre ALK3基因敲除小鼠饲养于SPF级动物实验室里，采用1只雄鼠与2只雌鼠同居的方 式进行繁殖。进行鼠尾DNA的提取，然后基因型鉴定，取胚胎，DEPC-PBS洗两 次，4％PFA固定，过夜(把胎鼠的编号标好，取鼠尾做PCR)，石蜡包埋，然后HE 染色。免疫荧光检查，一抗是sc．9305 cruz bmp7(santaus)，二抗是IF．0314 cruz aGOIgG／FITC(santaus)，石蜡切片常规脱蜡：二甲苯5分钟x3次，100％乙醇5分 钟2次，90％乙醇2分钟，70％乙醇2分钟，40％乙醇2分钟，PBS5分钟：枸橼酸缓 冲洗，微波抗原修复；．蒸馏水冲洗，PBS浸泡3分钟x2次，4％过氧化氢室温孵育 20分钟以清除内源性过氧化物酶的活性，PBS浸泡3分钟】(2次；正常羊血清室温孵 育20分钟，封闭非特异性抗原；吸去羊血清，然后加入一抗，4C孵育过夜；PBS 洗3次，加入二抗，避光孵育1h，PBS洗3次；磷酸甘油封片，荧光镜下观察。原位杂交 水于组织切片上，室温10分钟，以灭活内源性酶，蒸馏水洗；暴露mRNA核酸片 断：切片上滴]JH3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37C或室温消化15分钟，PBS洗3 次×5分钟，蒸馏水洗1次；后固定：N1％多聚甲醛室温固定10分钟，蒸馏水洗3次； 2-4h。吸弃多余液体，不洗；杂交： 预杂交：每切片加20I．tL预杂交液，湿盒中42C 每切片]1]20 16—20h；杂交后洗 J-tL杂交液，将硅化盖玻片置于切