ALS转基因小鼠腰髓自噬改变和饥饿诱导自噬对突变蛋白表达的影响.pdfVIP

中文摘要 ALS转基因小鼠腰髓自噬改变及饥饿诱导自噬对突变蛋白表达 的影响 摘 要 lateral 目的：肌萎缩侧索硬化(amyotrophic 神经系统变性疾病，其特征为选择性损害运动皮层、脑干及脊髓前角的运 动神经元，表现为肌无力、肌肉萎缩、肌束震颤、腱反射亢进及病理征阳 性，进行性加重，最终呼吸衰竭死亡。绝大部分的ALS为散发性(90％～ 氧化物歧化酶(SODl)基因突变有关。目前该病发病机制尚不清楚，但 随着病情进展突变SODl蛋白的聚集、泛素阳性包涵体的形成是ALS的 两个重要病理特征。突变的SODl蛋白首先发生错误折叠、构象改变，暴 露出蛋白内部的疏水残基，然后激活细胞内的蛋白酶体系统清除错误折叠 蛋白，但是此途径只能对单体蛋白的降解起到作用，在一定程度上延缓了 蛋白聚集物的形成。随着病程进展，受损蛋白的不断增多，当蛋白酶体系 统不足以完全清除这些蛋白的时候，蛋白酶体系统的成分如泛素也将参与 聚集物的形成，并捕获受损的细胞器，形成难以降解的包涵体，细胞自噬 可以降解具有聚集倾向的蛋白，因此细胞自噬溶酶体系统在SODl突变的 ALS转基因小鼠中对突变蛋白降解起着极为重要的作用。 自噬是一种生物长期进化保留下来的、受严格调节的、用于长寿命蛋 白质以及细胞器等胞浆成分的降解与循环再利用的生物过程。自噬现象首 先在酵母中被发现，后研究发现自噬普遍存在于真核细胞，通过溶酶体吞 噬降解自身成分，是细胞内再循环的系统，也是一种重要的防御和应激调 控机制，细胞在受到外界条件的刺激(如饥饿)或者其内部条件发生变化 (损伤的细胞器和胞质成分积聚)时都可以产生自噬。细胞可以通过自噬 和溶酶体降解消化变性衰老的细胞、受损细胞器或变性蛋白质等使之免受 细胞内毒物的损伤。自噬主要以细胞成分包括蛋白质和细胞器等在自噬体 中分隔，并在溶酶体中降解为特征。总体来讲，自噬被认为是一种非选择 性的降解机制。近来的研究表明自噬在很多生理和病理过程中扮演重要角 色，比如对于神经退行性疾病突变蛋白和受损细胞器的清除等。自噬可以 中文摘要 以调控长寿蛋白和细胞器的降解利用，参与细胞质的重建、维持细胞质的 稳定，所以一般认为长半衰期的蛋白、有聚集倾向的蛋白由自噬途径来降 解，无特异性，诱导性强。因此，自噬降解途径和ALS的发病可能存在 密切关系。 本实验应用家族性肌萎缩侧索硬化动物模型(SODlG93A转基因小 鼠)，研究疾病不同时期自噬相关指标的改变，并以饥饿作为细胞自噬的 诱导剂，观察饥饿诱导的自噬增强对ALS转基因小鼠病程不同阶段突变 蛋白表达的影响。旨在研究调节自噬在ALS治疗中的可能作用。 方法： l实验动物及分组 采用SODlG93A转基因小鼠及其同窝非转基因对照小鼠，实验期间每 天观察动物、称重及评分。将SODlG93A转基因小鼠按症状分为症状前期 (60天)、症状早期(100．120天)和终末期(130．150天)。60d同窝 分别以4％多聚甲醛灌流固定保存或新鲜取材。 2免疫组织化学法 4％多聚甲醛固定的脊髓腰膨大部位经振动切片机切成厚20I_un切片， 0．01M 二抗、辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素孵育后，DAB染色，捞片，脱 BX51显微镜观察及照相。 水，透明及封片。Olympus 3共聚焦显微镜法 4％多聚甲醛固定的脊髓腰膨大部位用20％蔗糖／4％多聚甲醛溶液浸 泡过夜至组织沉底。冷冻环境下使用包埋剂OCT包埋组织，经冷冻切片 机切成厚209rn切片，经漂洗、穿孔、封闭、一抗、荧光二抗孵育并再次 FVl000激光共聚焦显微 PBS漂洗后，抗荧光衰减封片剂封片，Olympus 镜观察及照相。 4透射电镜法 实验小鼠经4％多聚甲醛灌流固定后，准确定位腰髓前角并取材，继 PB漂洗，锇酸固定。丙酮梯度脱水，包埋 续固定于4％戊二醛中。0．1M