AnnexinⅡ蛋白的原核表达及AnnexinⅡ基因在急性白血病患者中的表达差异研究.pdfVIP

AnnexinⅡ蛋白的原核表达和AnnexinⅡ基因在急性白血病患者中的表达差异研究 中文摘要 Annexin II蛋白的原核表达和AnnexinⅡ 基因在急性白血病患者中的表达差异研究 中文摘要 Armexin II是钙介导的磷脂结合蛋白超家族成员之一，表达于内皮细胞、单核巨 噬细胞、神经细胞和一些肿瘤细胞。AnnexinII是纤维蛋白溶解酶原(PLG)和组织 型纤溶酶原激活物(t-PA)的共同受体，在血管内皮上能显著增加t--PA介导的纤溶 酶形成效率。目前研究发现，Annexin II异常高表达是M3型急性髓系白血病(APL) 出血合并症的重要机制之一。此外，研究发现AnnexinII还与某些实体肿瘤的侵袭和 转移、血管新生密切相关。鉴于ArmexinII的重要病理生理功能，本研究旨在基础和 临床两方面对AnnexinII的功能作进一步探讨。我们用大肠杆菌为宿主表达了 Annexin II融合蛋白，并以该重组蛋白为抗原免疫小鼠，用细胞融合和单克隆筛选技 术制备了抗AimexinII单克隆抗体，利用所制备的单克隆抗体初步建立了流式方法检 PCR) 测细胞表面AnncxinII蛋白的表达水平；此外还运用荧光定量PCR(Real-time 方法对急性白血病细胞株以及急性白血病病人骨髓单个核细胞AnnexinⅡmRNA的 表达水平进行了测定和比较，以进一步探索Annexin11的功能及可能的作用机制。 1．Annexin II蛋白的原核表达 我们利用含有Annexin 11转化大肠杆菌 II全长cDNA的质粒pET-T1／C2-Annexin II相对 分子量约39kDa，经Ni-NTA agarose柱纯化获得了部分纯化的蛋白后免疫Balb／c小鼠。 小鼠脾细胞与杂交瘤细胞融合后筛选获得二株持续分泌单克隆抗体的细胞株，命名为 测定其效价分别为5×10。5和6×10‘5。琼脂糖双扩散法显示两株抗体皆为IgGl亚类。 AnnexinⅡ蛋白的原核表达和AnnexinⅡ基因在急性白血病患者中的表达差异研究 中文摘要 Western blot分析显示两株单抗均能够识别相对分子量为39kDa的重组蛋白且能够特 制备出抗AnnexinII的特异性单克隆抗体，经过鉴定表明该抗体具有较高的特异性和 亲和力，对于进一步探讨AnnexinII的功能具有重要意义。 2．Annexin II在急性白血病患者中的表达差异及临床意义 本研究探讨急性白血病患者骨髓细胞AnnexinH基因的表达水平。建立荧光定量 PCR(Real-time II PCR)方法，检测急性白血病细胞患者骨髓单个核细胞Annexin mRNA的表达水平。实验结果显示：AnnexinII在NB4中的表达明显高于其它细胞 株，在U937以及SHI一1中也有较高表达。AnnexinII在初治M3型急性白血病患者 骨髓中的表达显著高于其它类型急性白血病和正常对照者，此外在初治M5、M4患 者骨髓中也有较高表达，而在初治M1以及M2患者中表达量与正常对照比无统计学 差异。结论：AnnexinⅡ除在M3中高表达外，在临床观察具有高度侵袭浸润能力的 类型M5、M4中也有较高表达，推测AnnexinII可能通过作为纤溶酶原、组织型纤 溶酶原激活剂的共同受体，促进纤溶酶的生成，从而起动蛋白水解级联反应，选择性 降解细胞外基质蛋白参与急性白血病的侵袭浸润过程。 关键词：AnnexinII；原核表达；单克隆抗体；荧光定量PCR；急性白血病