PCR熔解曲线法检测HBV基因型和RT-ARMS-qPCR法定量检测HBVYMDD突变的建立.pdfVIP

PCR 熔解曲线法检测HBV 基因型及RT-ARMS-qPCR 法定 量检测HBV YMDD 突变的建立 中 文 摘 要 目的： 1. 建立一种新的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）基因分型方法，并 应用此方法检测福建省乙肝患者的 HBV 基因型，了解福建省 HBV 基因型的分 布情况，并探讨基因型与肝纤维化、HBeAg 阳性率和HBV DNA 水平的关系。 2. 构建HBV 野生型YMDD 以及突变型YVDD 的标质粒标准品；建立高灵 敏度的RT-ARMS-qPCR 方法定量检测YMDD 及YVDD，并对该方法进行评价， 为HBV YMDD 耐药突变定量检测奠定基础。 方法： 1. PCR熔解曲线法检测HBV基因型的建立：根据文献报道的中国HBV B、C 型基因组全序列，分别设计B、C型特异性引物，以HBV B、C型的标准质粒为对 照标准品，建立一种新的基于PCR的熔解曲线法，根据PCR产物的Tm值判断基 因型并经测序验证；评价其灵敏度、特异性及重复性。 2. PCR 熔解曲线法检测HBV 基因型检测效能的评价：分别采用PCR 熔解 曲线法和市售的HBV 基因分型试剂盒对51 例HBV 感染者进行基因分型，比较 两法的一致性，评价PCR 熔解曲线法的检测效能。 3. PCR 熔解曲线法检测HBV 基因型的初步临床应用：收集 346 份HBsAg 阳性标本，利用所建立的PCR 熔解曲线法检测其基因型，以了解福建省HBV 基 因型的分布情况，探讨基因型与肝纤维化、HBeAg 阳性率以及HBV DNA 水平 的关系。 4. RT-ARMS-qPCR 法检测HBV YMDD 耐药突变的建立：以pMD-18T 为载 体，构建拉米夫定耐药相关的YMDD 野生株、YVDD 突变株质粒标准品，建立 RT-ARMS-qPCR 的定量标准曲线，并评价检测系统的敏感性、特异性及重复性。 结果： 1. 成功建立了PCR 熔解曲线法检测HBV 基因型 5 成功建立了检测HBV 基因型的PCR 熔解曲线法，可以根据Tm 值判断HBV 基因型。B 型Tm 值为80.79±0.35，C 型Tm 值为85.75±0.33；可以对HBV DNA 3 8 拷贝数≥10 copies/ml 的患者HBV 进行分型；重复性好，高（10 copies/ml）、中 6 4 （10 copies/ml）、低（10 copies/ml）浓度血清Tm 值的批内CV 值分别为0.15%、 0.09%、0.16%。 2. PCR 熔解曲线法检测HBV 基因型检测效能的评价 对随机选取的51 例HBV 感染者进行HBV 基因分型，PCR 熔解曲线法检测 为B 型的 14 份标本中，市售HBV 基因分型试剂盒检出 14 份B 型；21 份C 型标 本用市售试剂盒检出全部为 C 型；16 份 B/C 混合型的标本中，市售试剂盒的检 测结果为 1份B 型，2 份C 型，13份B/C 混合型。两种方法比较，B 型结果符合 率为 100%，C 型结果符合率为 100%，B/C 混合型结果符合率 81.25%，总体符合 率为94.12%（48/51，Kappa =0.909，P＜0.05）。 3. PCR 熔解曲线法检测HBV 基因型的初步临床应用 3.1 HBV 基因型分布 346 例HBV 感染者中，检出B 型 190 例，占54.91%， C 型82 例，占23.70%，B/C 混合型74 例，占21.39%，结果显示福建省乙肝患 者中以B 型HBV 感染为主。 3.2 HBV 基因型与肝纤维化、HBeAg 阳性率以及HBV DNA 病毒载量关系 346 例HBsAg 阳性的标本中91 例被确诊为肝纤维化，142 例标本进行了HBeAg 和HBV DNA 定量的检测，对其进行基因分型发现，91 例肝纤维化标本中检出C 型39 例，占42.86%（39/91），显著高于C 基因型在全部研究对象（346 例）中 所占的比例23.7%（82/346），而检出B 型38 例，占41.76%（38/91）