多种乙型肝炎毒突变株可调控性表达细胞系的构建.pdfVIP

I、l：、11．L 目 录 中文摘要 …………………………………………………………………l 英文摘要 …………………………………………………………………5 研究论文 引言 …………………………………………………………………10 第一部分 前言目U百 …………………………………………………．．……………．13…………………………………………………………………13 材料与方法 …………………………………………………………14 结果 …………………………………………………………………．18 附图 …………………………………………………………………20 讨论 …………………………………………………………………26 小结 …………………………………………………………………27 参考文献 ……………………………………………………………27 第二部分 前言日U吞 …………………………………………………………………29…………………………………………………………………29 材料与方法 …………………………………………………………29 结果 …………………………………………………………………31 附图 …………………………………………………………………33 讨{仑 …………………………………………………………………36 小结 …………………………………………………………………37 参考文献………………………………………………………………37 综j苤 …………………………………………………………………40 致谢 …………………………………………………………………51 个人简历 …………………………………………………………………52 中文摘要 多种乙型肝炎病毒突变株可调控性表达细胞系的构建 摘 要 乙型肝炎病毒(船V)持续感染是一世界性的卫生问题，慢性肝炎 终至肝硬化甚至肝细胞癌的发生。随着疫苗的普遍接种及抗病毒药物的广 泛应用，有效的降低了发病率及死亡率，但是也给人类带来一系列的问题： 疫苗／诊断逃逸突变以及核苷类似物长期应用引发耐药导致检测和治疗的 失败。这些突变株与野生株相比，在生物学特性方面必然有其特殊性。为 了进一步了解突变株对病毒复制力、疫苗接种效能所带来的影响，以及研 究核苷类似物的耐药机制、筛选新型药物，有必要建立全基因组的细胞模 够支持乙肝病毒的复制。然而，由于缺乏复制的稳定性，对药物筛选等高 5细胞系是目前公认的应用最广泛的 要求的实验是不适用的。HepG2．2．1 乙型肝炎细胞模型，并且被广泛应用于抗病毒研究。不仅病毒复制均衡、 变异小，而且经多代培养仍可以长时间地维持病毒复制。但是病毒复制水 平较低，并且不能人为控制。为解决目前面临的难题，有必要构建一个稳 系统是目前研究和应用最为广泛的真核细胞基因表达系统。本研究就是利 用PCR、酶切等手段构建多个HBV全基因组突变株，转染前期已构建成 功的tTA细胞系，用潮霉素筛选，构建多个突变株可调控性表达细胞系， 诊断试剂盒及其变异监测、研究耐药机制、筛选新型抗病毒药物奠定了实 验基础。本研究共分2部分完成。 第一部分多种HBV突变株可调控性表达细胞系的构建 上，构建8个HBV全基因组突变株。通过转染前期实验构建成功的tTA 细胞系，构建多种突变株可调控性表达细胞系，观察病毒表达情况，证明 稳定复制能力及可调控性。 方法： 中文摘要 181 181T-N23 pTRE-HBV-A TpTRE．HBV-N236T,pTRE．HBV-A6T, 1 173L．L180M pTRE-HBV-M2