钙调素拮抗剂枸橼酸汉防己甲素抗慢性粒细胞白血病作用和其机制研究.pdf

钙调素拮抗剂枸橼酸汉防己甲素抗慢性 粒细胞白血病作用及其机制研究 浙江大学医学院 内科学(血液病学) 博士研究生 许晓华 导 师 赵小英教授 中文摘要 研究背景： 慢性粒细胞白血病(chronic leukemia，CML)是一种造血干细胞的克隆性 myeloid 疾病，约占成人白血病的15％．20％，是严重危害人类健康的血液系统恶性肿瘤。 有酪氨酸激酶活性，促进细胞异常增殖，导致CML的发生和发展。伊马替尼 年获美国FDA批准成为治疗CML的一线药物。然而，已有越来越多的临床和实 验研究资料显示，伊马替尼虽然对CML慢性期患者有较好的疗效，却对急变期 CML疗效较差，而且随着伊马替尼的广泛应用，发现有相当一部分患者出现耐药。 研究认为分子靶向药物对急变期CML无效主要与其致病基因bcr-abl发生突变有 关，如T315I突变。T315I突变患者不仅对第一代酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼耐药， 来，随着对白血病细胞生物学和分子生物学特性研究的深入，发现白血病干细胞 (1eukemiastem cell，LSC)不仅是CML对分子靶向药物耐药的关键因素，而且在 IT 白血病起始和复发中也起着重要的作用，LSC是CML长期缓解和治愈的主要障碍 之一。CML患者要获得长期缓解和治愈，必需清除这些白血病干细胞。因此，筛 选和鉴定白血病干细胞治疗性药物靶标，阐明其作用分子机制，以及研发相应药 物是目前迫切需要解决的问题之一。目前抗肿瘤药物大多存在毒副反应大，价格 昂贵等不足，因此寻找高效低毒价廉的抗肿瘤药物和方法，提高患者生存质量已 成为医学研究的热点。 tetrandra S．Moore)块根中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱，是 已(Stephamia 一种钙调素拮抗剂，对多种肿瘤细胞株具有明显的增殖抑制作用。有文献报道钙 发现CaMKII丫在髓系白血病细胞中呈异常激活状态并调节白血病细胞的增殖。汉 防己甲素对慢性粒细胞白血病急性变白血病细胞株K562细胞和多药耐药株 K562／ADM细胞体内外均有较好的抗增殖和逆转多药耐药的作用，但其作用机制 尚缺乏深入的研究。因此，本文以K562细胞及伊马替尼耐药的K562R细胞和慢 性粒细胞白血病患者原代细胞为研究对象，探讨钙调素拮抗剂枸橼酸汉防己甲素 (Tetrandrine citrate，TTDC)体内外抗慢性粒细胞白血病作用及其可能的机制。 第一部分：枸橼酸汉防己甲素抑制人慢性粒细胞白血病细胞增殖的体 外研究 目的：检测枸橼酸汉防己甲素对人慢性粒细胞白血病细胞增殖抑制作用。 性粒细胞白血病患者原代细胞，采用MTT检测处理前后对白血病细胞的增殖抑制 量及细胞凋亡；甲基纤维素克隆形成试验检测TrDC对白血病细胞克隆的增殖抑 制作用；运用WesternBlot技术检测BCR—ABL蛋白及其磷酸化蛋白表达。 h、 I!I 48h、72 h能显著抑制K562细胞和K562R细胞的增殖，其作用具有浓度．时间依 赖性，TTDC对K562细胞和K562R细胞在48h 同样TTDC对慢性粒细胞白血病患者原代细胞也具有增殖抑制作用而对正常造血 细胞没有明显抑制作用。TIDC处理K562R细胞出现凋亡细胞形态学的改变和凋 分别处理48h后， 早期凋亡细胞比例分别为3．1％，7．3％，50％和76％，呈明显递 增趋势，甲基纤维素克隆形成试验结果显示TTDC能抑制CML细胞克隆形成，同 时观察到经TTDC作用后P210Bc艮ABL蛋白表达量明显下降。 赖性，对慢性粒细胞白血病患者原代白血病细胞增殖和克隆形成具有抑制作用而 对正常外周血单个核细胞抑制作用不明显；TTDC对白血病细胞增殖抑制作用与诱 导细胞凋亡和抑制CML关键性分子P210Bc艮ABL蛋白