高糖、PKC对原代培养的腹膜间皮细胞葡萄糖转运蛋白1调节作用的探究.pdfVIP

中文摘要 目 的 随着腹膜透析(PD)技术的不断成熟，腹透已成为终末期肾衰竭(ES． RF)一体化治疗的重要组成部分，腹膜结构和生理功能的稳定是PD能够长 期有效进行的关键。作为腹膜的第一道生理屏障一腹膜间皮细胞(PMCs) 长期暴露在酸性、高渗透压、高糖的非生理性腹透液中，其结构和功能发生 显著变化：如细胞体积增大，细胞外基质增多，细胞增殖受抑制，再生修复障 碍，以致发生腹膜纤维化、腹膜通透性增加，葡萄糖吸收加快，而高糖是造成 PMCs损害，超滤下降、丧失的主要原因。 葡萄糖无法自由通过细胞膜脂质双层结构进入细胞，需借助细胞膜上 的葡萄糖转运蛋白来完成，葡萄糖转运蛋白是调控细胞内糖摄入及糖代谢 的第一限速步骤。实验证实易化扩散性葡萄糖转运蛋白1(GIⅢT1)是腹膜 问皮细胞表达的主要转运蛋白，因此，细胞膜上GLUTl含量变化决定了间 皮细胞对葡萄糖的转运。 已知蛋白激酶C(PKC)的激活参与了糖尿病肾病的发生发展，体外培 养的骨骼肌细胞在高糖刺激下，葡萄糖转运的增加是通过PKC途径完成 的，同时实验证实腺病毒转染的骨骼肌细胞过度表达PKC可促进GLUTl 由储存囊泡向细胞膜转运，且能增加GLUTl活性。 GLUTl的影响，为进一步探讨如何减少葡萄糖的吸收，从而增加UF提供理 论依据。 方 法 1．胰蛋白酶消化法进行雄性Wistar大鼠PMCs的原代培养 2。间接免疫荧光法用于PMCs细胞膜上GLUTl的鉴定 3．流式细胞仪技术定量检测细胞膜上GLUTl的含量 4．观察高糖、PMA及PKC抑制剂对细胞膜上GLUTl含量的调节 5．己糖激酶法检测培养液内的葡萄糖浓度 结 果 l。腹膜问皮细胞GUJTl的鉴定 我们拥有成熟的腹膜间皮细胞培养技术，光镜下观察培养的细胞为多 角形，融合时呈铺路石样外观，为典型的上皮细胞形态表现。荧光显微镜 下，GLUTl抗体标记的细胞呈绿色荧光，而应用正常兔血清代替一抗孵育 的细胞则未见到绿色荧光标记，说明PMCs表达GLUTl。 2．葡萄糖对细胞膜上GLUTI的调节 不同浓度的葡萄糖分别刺激PMCsih、24h，流式细胞仪检测细胞悬液， Cell 可见随着葡萄糖浓度的升高，细胞膜上GLUTl的表达量明显增加，4．25％ 激1h时，GLUTl的表达量较前有明显下降，几乎降至正常糖浓度的水平。 3．细胞外高糖刺激PMCs对葡萄糖转运增加(P0．05) 4．PMA以剂量和时间依赖方式诱导细胞膜上GLUTl的表达 MFI，GLUTl于作用24h时表达量最高(P0．05)。 5G{i6976对PMA诱导GLUTl作用的影响 结 论 1．大鼠PMCs普遍表达GLUTl。 时伴有PMCs对葡萄糖转运的增加。 程。 运减少，跨膜浓度梯度能有效维持，故应用PKC抑制剂成为增加超滤的途 径之一。 关键词：腹膜间皮细胞；葡萄糖转运蛋白1；高糖；蛋白激酶C ·2· and of Glucose ExpressionRegulation Transporterl in Peritoneal MesothelialCellsof Culture Primary Postgraduate：DING Hong Adviser：MAJian—fei ABsII‘RACT