高糖毒性对心肌细胞的直接伤害作用和Ghrelin干预研究的探索.pdfVIP

·中文论著摘要· 高糖毒性对心肌细胞的直接伤害作用 及Ghrelin干预研究的探索 刖 罱 糖尿病(Diabetes 年患病人数达2．40亿，到2025年可达2．99亿。由于糖尿病可以引起冠心病、脑 卒中、失明、截肢等严重后果，糖尿病及其并发症的防治已经给各国造成了严重的 经济负担和社会压力。心血管疾病是DM患者致残、致死，并造成经济损失的主 要原因，现已把防治心血管并发症作为当今治疗DM的主题，也就是说完成了从 DM的昏迷时代到感染时代到心血管时代的飞跃。 糖尿病是冠心病的等危症，糖尿病引起心血管并发症的危害性已逐渐受到重 视。目前，糖尿病对心脏的损害局限于对大血管、微血管、动脉粥样硬化的研究， 国内外对糖毒性对心肌细胞的直接伤害报道少见。本文通过以体外培养的H9C2心 肌细胞为模型，探讨不同糖浓度环境下心肌细胞糖代谢状况的表达，发现高糖情 况下心肌细胞存在胰岛素抵抗及凋亡，揭示糖毒性对心肌细胞存在直接伤害作用， 为糖尿病对心脏的损害阐明另一途径。 28个氨基酸组成的小分子活性肽，并证实其为生长激素促分泌物受体(Growth hormone secretagogue 的能量代谢、内分泌效应、血管效应及细胞效应方面发挥了广泛的作用，Ohmlin 肌损伤等病变的防治上具有广阔的前景。 目前国内外并未见ghrelin干预后心肌细胞糖代谢的变化及对糖毒性的影响的 报道。我们知道P13．Kinase／AKT通路是细胞内重要的信号转导通路，这条通路不 仅在胰岛素信号转导中起到很重要的作用，同时也是细胞凋亡过程中重要的一环。 及蛋白定量检测，揭示出Ghrelin对高糖作用下的心肌细胞起到保护作用的机制。 本文力求对高糖引起的心肌细胞的直接伤害作用及Ghrelin的功能的深入研究作 出贡献，为临床治疗提供新的方向与思路。 材料与方法 一、实验材料 l、H9c2大鼠心肌细胞系 2、3H．G(3氚标记一葡萄糖)心肌细胞糖摄取实验相关试剂 3、免疫荧光染色的相关试剂 4、流式细胞仪检测凋亡的相关试剂 5、半定量RT-PCR检测基因mRNA的相关试剂 6、Western印迹杂交相关试剂 二、实验方法 1、细胞培养 条件下进行培养，隔天换液，细胞单层生长达80％培养面积后，用0．25％胰蛋白 酶消化，根据情况1：2或1：3传代，将传至6．7代的细胞用于实验。当细胞呈对数 生长后，调整细胞数为lx106／L，接种于6孔培养板或30IIlIll培养皿中，待细胞生 长至融合状态后用无血清培养基培养24h使细胞呈静止状态，更换实验用液随机 分配为实验组及对照组进行实验。 2、实验分组 A，5．5retool／1葡萄糖+10mU／ml胰岛素； B、25mmol／l葡萄糖+10mU／ml胰岛素； 0’8mol／L C、5．5retool／1葡萄糖+10mU／ml胰岛素+1 Ghrelin： D，25retool／1葡萄糖+10mU／ml胰岛素+10一mol／LGhrelin； E、5．5retool／1葡萄糖+10mU／ml胰岛素+10～mol／LGhrelin； F、25 Ghrelin。 mmol／1葡萄糖+10mU／ml胰岛素+10_mol／L 3、同位素示踪法检测不同葡萄糖浓度时，心肌细胞3氚标记．葡萄 2 糖(3H．G)摄取的变化 待传代培养后的细胞处于80．90％融合状态时用于实验。Ⅺ王H缓冲液洗涤细 30分钟。用预冷的PBS冲洗3次， 孵育30分钟。加入3H．G至终浓度0．2uCi／ml 二甲苯)2ml，液体闪烁计数法测定检测各组的CPM值。 4、吖啶橙(AcridineOrange，AO)荧光染色