Osterix过表达对人牙周膜细胞骨向分化影响.docVIP

Osterix过表达对人牙周膜细胞骨向分化影响[摘要] 目的 研究Osterix（Osx）过表达对人牙周膜细胞受力后骨向分化的影响，探讨Osx与正畸牙周组织骨改建的关系。方法 采用组织块法培养人牙周膜细胞，用重组质粒pcDNA3.1 flag-Osx转染人牙周膜细胞。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot方法检测未转染组、转染空质粒组、转染Osx组细胞Osx mRNA和蛋白表达水平；并观察核心结合因子α1（Cbfα1）、碱性磷酸酶（ALP）、骨桥素（OPN）、骨钙素（OC）、骨涎蛋白（BSP）和a1（Ⅰ）型胶原蛋白（Col Ⅰ）的mRNA表达情况。3组细胞加载6 h离心力后，观察上述检测指标的变化。结果 转染24 h后，相对未转染组，转染空质粒组Osx mRNA和蛋白水平无明显变化（P0.05）；而转染Osx组Osx mRNA和蛋白表达水平明显升高（P0.05）。加力6 h后，3组Osx表达水平均明显升高，但是相对转染空质粒组和未转染组，转染Osx组Osx mRNA和蛋白表达增强更显著，增加量约为其他两组的2倍（图4、5）。 2.4 转染加力后Cbfα1和成骨标志基因的表达变化 转染空质粒组与未转染组相比，Cbfα1及5个成骨标志基因（ALP、OPN、OC、BSP 和Col Ⅰ）的mRNA表达变化无明显差异（P0.05）。与未转染细胞相比，细胞转染Osx后，Cbfα1 mRNA表达无明显变化（P 　　0.05），但5个成骨标志基因的mRNA表达均明显升高（ALP、Col Ⅰ为P0.05）；而转染Osx组与未转染组相比，受力后ALP、OPN、OC、BSP和Col Ⅰ mRNA表达量升高更显著（P0.05）（图6）。 3 讨论 Osx是成骨细胞分化和骨形成不可缺少的调节因子[10]，其调控许多重要的成骨早晚期表型和功能蛋 白的表达[5]。Osx过表达可以抑制C3H10T1/2、C2C12 细胞向原来方向分化，同时激活OC和Col Ⅰ的表达，促使细胞发生成骨分化。而在Osx基因剔除小鼠胚胎中，各种成骨分化标志物的表达水平严重降低或缺如，成骨细胞的分化、成熟被完全阻断[7]。本实验在 目的质粒转染及机械加载前后分别检测了5个成骨标志基因mRNA的表达变化。在成骨分化过程中，ALP是一组膜结合糖蛋白，其活性在成骨分化早期即开始升高，ALP的表达是成骨细胞分化的主要特征之一。OPN是基质矿化的调节基因[11]，OPN mRNA在 成骨细胞分化的早期即开始表达；在牙齿发育中，OPN的表达早于BSP，可以作为成骨样细胞分化的早期标志。Col Ⅰ是基质矿化支架，通过整合素受体增加成骨细胞黏附能力和发挥促分化作用[12]。BSP是羟 磷灰石结合形成的起始位点[13]，可以刺激细胞的增 殖，并促进前成骨细胞分化为骨细胞。BSP的表达早于OC，在成熟晚期即开始表达。OC是细胞外基质蛋白，它是成骨细胞成熟的标志[14]，OC mRNA表达在矿化期开始，并逐渐达到高峰。 本实验转染空质粒组与未转染组相比，ALP、OC、OPN、Col Ⅰ和BSP mRNA表达未出现变化，排除了脂质体转染后对实验结果的影响。转染目的基因Osx后，Osx过表达未改变Cbfα1基因的表达，与以往研究结果相一致，这可能是因为Osx位于Cbfα1下游发挥作用[5]；但Osx过表达显著增强了ALP、OPN、BSP、OC和Col ⅠmRNA的表达。以往研究已证明Osx单独作用就足以促使许多重要的成骨细胞分化早晚期标志基因的表达，发生矿化反应[5]。本实验结果说明Osx过表达通过增强ALP、OPN、OC、BSP和Col Ⅰ这些成骨标志基因的表达，能够促进人牙周膜细胞向成骨样细胞分化，进而合成骨基质，实现矿化成骨。正如Osx过表达能有效诱导鼠胚胎干细胞[15]、骨髓基质细胞[16]等分化为成骨细胞系。OC的显著上调部 分说明Osx单独作用即可诱导人牙周膜细胞发生终末成骨分化。由此可以推测，机械力诱导的人牙周膜细胞内Osx高表达同样也将刺激这些成骨分化早晚期表型和功能基因的表达，推动细胞发生成骨分化。因此，从某种程度上来说，机械刺激诱导人牙周膜细胞的成骨分化需要通过上调Osx的表达来实现。 转染Osx组与未转染组相比较，加力作用6 h后，Osx mRNA和蛋白表达进一步增强，ALP、OPN、Col Ⅰ、BSP和OC mRNA表达增强更显著，实验结果证明在机械力诱导人牙周膜细胞向成骨样细胞分化过程中，Osx起着促进作用。机械刺激引起Osx表达增强，进而增强成骨标志基因的表达，从而促进人牙周膜细胞向成骨样细胞分化，参与牙周组织改建的骨形成和骨吸收。可见，Osx作为一个关键的中间环节，在机械力诱导人牙