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他汀类药物对巨噬细胞胱硫醚-γ-裂解酶/硫化氢通路的调控及其机制研究 中文摘要 他汀类药物对巨噬细胞胱硫醚- γ- 裂解酶/硫化氢通路的调控及其机制研究 中文摘要 目的：气体信号分子硫化氢参与多种病理生理过程。在心血管系统，硫化氢发挥 心脏保护、血管调节和抑制动脉粥样硬化发生的作用。最近的研究证实HMG- CoA还原酶抑制剂阿托伐他汀增加了肾脏和其他器官中硫化氢水平。然而，其内在的 机制并不明确。在本研究中，我们研究并比较三种不同的他汀氟伐他汀、阿托伐他汀 和普伐他汀对巨噬细胞内硫化氢水平的调节，并探讨其可能的分子机制。 方法：以小鼠巨噬细胞raw264.7为工具细胞株，以三种具有不同理化性质、临床常 用的不同浓度的他汀类药物氟伐他汀（脂溶性，1.25, 2.5, 5,10μM）、阿托伐他汀（脂溶性, 10, 25, 50,100μM）和普伐他汀（非脂溶性，25, 50,100μM）分 作用不同时间（24、36、48小时）。分 以经典的亚甲蓝法和特异性荧 光探针WSP-1检测培养上清和细胞内硫化氢水平；以定量PCR和western blotting检测硫化氢合成酶胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）和巯基丙酮酸硫转移酶（3- MST）的mRNA和蛋白表达；利用NADH 的氧化联合乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒检测细 胞内CSE活性；以siRNA干扰敲减cse基因；以western blotting检测细胞内Akt磷酸化水平变化；采用定量PCR测定细胞因子IL-1β和MCP-1 mRNA表达。 结果：三种他汀都会随着浓度的增加而降低细胞的活力。选择以不产生明显细胞 毒性作用的2.5μM氟伐他汀、50μM阿托伐他汀和普伐他汀观察比较其对巨噬细胞中 硫化氢水平的影响，发现氟伐他汀和阿托伐他汀可以显著增加细胞内、外的硫化氢水 平，而普伐他汀却没有显著作用。氟伐他汀和阿托伐他汀呈时间和剂量依赖性地增加 硫化氢合成酶CSE的mRNA和蛋白表达；但是这两种他汀均不影响另一个硫化氢合成 酶3- I 他汀类药物对巨噬细胞胱硫醚-γ-裂解酶/硫化氢通路的调控及其机制研究 中文摘要 MST的mRNA和蛋白表达。而且，2.5μM氟伐他汀处理48小时后CSE活性增加4.4倍。C SE抑制剂炔丙基甘氨酸（PAG）和CSE的干扰RNA(siRNA)能够显著降低氟伐他汀引起 的硫化氢水平的增加。另外，氟伐他汀作用后15分钟，巨噬细胞内Akt磷酸化水平即显 著增加，于1- 3小时达高峰，6小时开始下降。PI3K抑制剂LY294002和Akt特异性抑制剂perifosine可 以逆转氟伐他汀引起的CSE表达上调和硫化氢水平的增加。最后，我们发现氟伐他汀 预处理可以减少细菌脂多糖诱导的促炎细胞因子IL-1β和MCP- 1的表达；而CSE抑制剂PAG可以逆转氟伐他汀的该作用。 结论：在巨噬细胞中，亲脂性他汀氟伐他汀和阿托伐他汀能够通过上调CSE的表 达及活性而促进硫化氢的产生，从而发挥抗炎症作用，而非脂溶性的普伐他汀没有这 种作用。Akt信号通路介导了氟伐他汀对CSE表达及硫化氢生成的促进作用。胱硫醚- γ-裂解酶/硫化氢通路可能是他汀抗炎作用的另一个作用机制。 关键词：硫化氢；他汀；胱硫醚-γ-裂解酶 ；3-MST ；巨噬细胞； 丝氨酸/苏氨酸激酶 作 者：徐 元 指导老师：刘春风 II 他汀类药物对巨噬细胞胱硫醚-γ-裂解酶/硫化氢通路的调控及其机制研究 英文摘要 The effect and underlying mechanisms of statins on cystathionine γ-lyase-H S pathway