北方汉族人群PAH基因STR多态性分析及PKU产前基因诊断研究.docVIP

北方汉族人群PAH基因STR多态性分析及PKU产前基因诊断研究 姜莉　金春莲　张学　林长坤　李红杰　孙桂凤　金春元　佟秉政　曲陆荣　孙开来 　　苯丙酮尿症(PKU)是由肝脏苯丙氨酸羟化酶(PAH)缺陷引起的常染色体隐性遗传病。临床主要表现为智力低下。研究表明，PKU的分子基础主要是PAH基因的点突变。到1996年，汇集28个国家研究成果的PAH基因突变数据库已登记320余种PAH突变［1］。目前，直接检测PAH基因突变进行PKU基因诊断受到较大限制。我们应用PCR技术，分析了63例遗传上无相关的北方正常汉族个体的STR多态性分布，并联合应用PCR-STR连锁分析及PCR-DGGE突变检测技术，成功地进行了13例PKU高危胎儿的产前基因诊断，同时建立一种安全可靠、简便快速的PCR检测方法。 1　材料和方法 1.1　样品来源及DNA提取　13个经典型PKU家系的外周血及胎儿羊水(妊娠16～20周)标本由中国医科大学第二临床医院提供。63例遗传上无相关的北方正常汉族个体由中国医科大学第一临床医院提供。按本室常规方法提取基因组DNA。1.2　方法1.2.1　PCR-STR连锁分析　根据文献［2］报道合成PCR引物。按前文报道方法PCR扩增后[3]，在含7mol尿素的6%聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离。电泳条件为50℃、40W、1小时30分钟，凝胶经Green-1荧光染料染色30分钟，于自动凝胶成像仪上观察、贮存。1.2.2　PCR-DGGE突变检测分析　根据文献［4］分别合成用于DGGE的特殊引物E6、E7和E12。方法同前。扩增产物采用DGGE分析，制备6%聚丙烯酰胺/TAE凝胶，变性梯度范围为20%～80%，电泳条件为60℃、150V、6小时。泳毕，凝胶经溴化乙锭染色，于自动凝胶成像仪上观察、贮存。 2　结果 2.1　STR等位片段长度的多态性分布　应用F-dUTP标记PCR产物经毛细管高压电泳，GeneScan分析随机鉴定5例PKU家系成员STR等位片段长度，再依其为参考分子量标准，检测来自北方地区遗传上无相关的正常汉族个体63人，总计126条染色体，共检测出7种等位片段(表1)，依次为232bp(A)、236bp(B)、240bp(C)、244bp(D)、248bp(E)、252bp(F)和256bp(G)，其等位基因频率分别为0.056、0.103、0.048、0.206、0.444、0.111和0.032。根据如上检测结果计算其PIC为0.731。 表1　北方汉族人群PAH基因STR等位片段的分布 等位片段长度 染色体数 等位片段频率 多态信息量 232(A) 　7 0.056 236(B) 13 0.103 240(C) 　6 0.048 244(D) 26 0.206 0.731 248(E) 56 0.444 252(F) 14 0.111 256(G) 　4 0.032 合计 126 1.000 2.2　产前基因诊断结果　13个PKU家系的产前基因诊断结果如表2所示。表型正常的11例，其中8例已出生，于生后1～2周取血查血苯丙氨酸浓度均属正常，2例尚未出生，另1例因家庭问题于7个半月终止妊娠，取脐带血验证与羊水结果相同；PKU患儿2例，于5个月引产。产前诊断的代表性结果见图1，2。 表2　PKU家系的产前基因诊断结果及生后验证 家系 STR等位片段 产前诊断结论 综合判断 出生后验证 先证者 父亲 母亲 胎儿 STR分析 DGGE分析 　1 C/E D/E C/F C/D 携带者 　 　 出生，正常 　2 A/D A/E D/F D/E 携带者 　 　 出生，正常 　3 E/E D/E B/E B/D 正常　 　 　 出生，正常 　4 E/F D/E E/F E/F 患儿　 　 　 5个月引产 　5 E/F E/F D/E D/F 携带者 　 　 7个半月引产 　6 F/F C/F E/F C/E 正常　 　 　 出生，正常 　7 D/D D/E D/F D/F 携带者 　 　 出生，正常 　8 E/E E/F E/F E/E 患儿　 　 　 5个月引产 　9 D/E D/E D/E D/E 不提供信息 E7正常 　 出生，正常 10 D/E E/E A/D A/E 正常或携带者 　 　 出生，正常 11 F/F E/F F/F E/F 正常或携带者 　 　 出生，正常 12 D/D D/E D/D D/D 携带者或患儿 E7正常 携带者 尚未出生 13 B/E B/F E/E E/F 正常或携带者 　 　 尚未出生 图1　家系1、2、3的PAH基因PCR-STR连锁分析 图2　家系9的产前基因诊断结果 3　讨论 3.1　北方汉