IL-18-PE38真核表达质粒构建及表达.docVIP

IL-18-PE38真核表达质粒构建及表达 　 作者：代吕霞，李 虹，陈登榜，曾俊 【关键词】 免疫毒素 基因重组免疫毒素是通过基因工程技术将具有导向能力的分子(载体)和具有细胞毒性的分子(毒素)偶联而成的具有特异性细胞杀伤能力的杂合分子。它具有分子小，产品均一性高，活性高，异源性低，易于大规模制备等优点，是研究免疫毒素进程中的一大飞跃。在治疗肿瘤，异体移植排斥，自身免疫疾病及慢性感染性疾病等方面表现出巨大的潜力。迄今为止，已有一系列重组免疫毒素在体外实验和动物实验中显示出良好的效果［1～4］。本实验首先通过RT-PCR获得了mIL-18基因片段，然后将具有导向作用的IL18和具有细胞杀伤作用的PE38的基因构建成IL18-PE38融合基因真核表达载体，并将其转染到NIH3T3细胞，观察其目的蛋白的表达情况，为进一步研究IL18-PE38重组免疫毒素对自身免疫性疾病基因治疗的作用奠定基础。 1 材料和方法 1.1 载体和细胞株含有PE38基因的载体PRKL459K为本室保存。真核表达载体Psec Tag 2B为invitrogen公司产品。感受态菌JM109为Takara公司产品。NIH3T3细胞为本校细胞生物教研室提供。 1.2 试剂RT-PCR试剂盒为Takara公司产品。Trizol Reagent为GibicoBRL公司产品。限制性内切酶、T4DNA连接酶为New England公司产品，DNAmarker为Promega公司产品。凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒为上海华舜生物工程有限公司产品。DMEM培养基为invitrogen 公司产品。脂质体为Qiagen公司产品。新生小牛血清为成都哈里公司。抗IL-18多克隆抗体(C-18):sc-6177为Santa CrusBiotechnology公司产品。FITC标记兔抗山羊IgG、封闭用羊血清原液均为北京中山公司产品。 1.3 IL-18cDNA的制备用Trizol一步法提取小鼠肝总RNA，然后用RT-PCR试剂盒进行逆转录及扩增。PCR引物，上游为：5’-GGAATTCCATATGAACTTTGGCCGACTTCAC- TGTAC-3’(含Nde1酶切位点)；下游为:5’-CCCAAGCTTACTTTGATGTAAGTT-AGTGAGAGTGAA-3’(含HindIII酶切位点)，反应体积为50μl，反应参数为：逆转录为42℃ 45min；PCR为94℃ 3 min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 45s，30个循环后72℃延伸10 min。扩增产物行1％琼脂糖凝胶电泳分析。 1.4 Psec Tag2B-IL-18-PE38真核表达载体构建及鉴定 回收纯化RT-PCR产物后经Nde1和HindIII双酶切，回收纯化；HindIII和EcoRI双酶切质粒PRKL459K-PE38和载体Psec Tag2B，同样电泳回收纯化，T4连接酶作用下16℃连接过夜，产物转化E.coli JM109感受态细胞，挑取单克隆于3 ml LB培养基中37℃培养过夜，小量提取质粒DNA，分别用PCR和酶切反应进行鉴定，将阳性克隆菌株进行序列测定。 1.5 细胞转染取冻存的NIH3T3细胞复苏，次日更换培养液。当细胞生长达50％～80％瓶底面积时，用0.25％胰酶消化细胞，调整细胞浓度，以5×106/孔接种6孔板，当细胞生长达70％瓶底面积后，用Psec Tag2B-IL-18-PE38重组质粒进行转染，以Psec Tag2B空质粒作为对照，转染试剂为脂质体，具体方法参照说明书和《分子克隆》进行。转染24 h后换新鲜10%小牛血清DMEM培养基2 ml，继续培养。 1.6 荧光免疫化学法测定表达情况转染后48 h，将细胞爬片用PBS洗涤2次，用免疫荧光法检测目的蛋白的表达情况，其主要步骤如下：4%多聚甲醛室温固定，滴加封闭血清，室温孵育30 min，滴加IL-18抗体(1∶500)20μl，4℃过夜，PBS洗3次，每次2 min，滴加荧光标记二抗(1∶100)20 μl，37℃孵育30 min，PBS洗3次，每次2 min，然后50%甘油封片，荧光显微镜观察结果并照片。 2 结果 2.1 IL-18cDNA的获得通过RT-PCR得到一条大小约480 bp的单一特异性条带，与预期的mIL-18片段大小相符(见图1)。 图1 RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳 Fig.1 Electrophoretic analysis of RT-PCR product 1.DNA marker；2.RT-PCR product 2.2 Psec Tag2B-IL-18-PE38真核表达载体鉴定 分别将重组质粒Psec Tag2B-IL-18-PE38和Psec Tag