丙肝病毒核心基因克隆载体pGEMHCV-core构建.docVIP

丙肝病毒核心基因克隆载体pGEMHCV/core构建 　 【摘要】 目的 构建丙肝病毒核心基因克隆载体pGEM-HCV/core，为进一步 研究 外部引导序列（external guide sequence, EGS）引导核糖核酸酶P在RNA水平阻断丙肝病毒核心基因的表达做好前期基础。 方法 将含HCV全长基因的pBRTM／HCV1301l质粒于大肠杆菌JMl09内扩增；提取pBRTM／HCV1301l质粒；从pBRTM／HCV1301l质粒中PCR扩增出HCV核心基因片段并将其插入pGEM3Z克隆载体；以得到重组的pGEM-HCV/core克隆载体；最后EcoR I and Hind III双酶切鉴定HCV核心基因克隆载体。结果 pGEM-HCV/core克隆载体经双酶切、凝胶电泳证明插入片段与HCV 核心基因片段大小相符；经测序证明其插入序列与HCV core基因序列一致。结论 成功构建了HCV 核心基因的克隆载体pGEM-HCV/core。 【关键词】 HCV；core基因；载体；EGS 论文代写 　　Abstract:Objective To construct the clone plasmid containing the core gene of HCV, preparing for the research of blockage of the expression of HCV core gene guided by EGS at the level of mRNA.Methods After expanding plasmid pBRTM /HCV13011 (containing the whole genome of HCV) through E. coli JM109. The core gene with pBRTM /HCV13011 is amplified with PCR as the template; The core segment was inserted into the clone plasmid pGEM3Z. Plasmid pGEM-HCV/core was digested with EcoR I and Hind III. Results The PCR result of HCV core has correct size and sequences. Conclusion The clone plasmid pGEMHCV/core has successfully been constructed. 毕业论文 　　Key words:HCV; core gene; vector; EGS 毕业论文 　　在HCV的众多基因片段中，核心蛋白基因具有包裹病毒核酸、维持病毒外形的功能，是导致病毒持续感染的关键因素。因此通过阻断丙型肝炎病毒核心基因的表达以抑制丙肝病毒复制的研究已受到广泛的关注。本研究旨在采用pGEM3Z克隆载体构建pGEMHCV/core克隆载体，为进一步研究指导序列性M1核酶(M1 ribozyme of guide sequence,M1GS)在RNA水平阻断HCV 核心基因的表达，为开展包括抗HCV疫苗和药物研发等临床 应用 提供重要的物质基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　 　　大肠杆菌菌株JM109，购自鼎国生物公司。用CaCl2法制备感受态菌，-80 ℃保存。质粒pBRTM ／HCV13011，由美国华盛顿大学Rice教授惠赠，具有HCV全长基因；pGEM3Z克隆载体由本试验室保存。 　　1.2 主要试剂 　 　　EcoRI、HindIII、T4 DNA连接酶及Taq酶均购自大连宝生物公司。DNA MarkerIII及DNA Marker DL2000分别购自北京奇华盛生物公司及威佳生物公司。质粒提取试剂盒购自康龙生物公司。DNA片段纯化试剂盒购自尚能生物公司。 论文代写 　　1.3 引物 　　上游引物：5′GGCGAATTCATGAGCACGAATC CTAAAC 3′(包含EcoRI位点)；下游引物：5′CCTAAGCTTGGCTGAAGCGGGCAC 3′(包含HindIII位点)；引物由英俊生物公司合成。 　　1.4 方法 　　1.4.1 质粒的扩增及纯化 　　应用0.1 mol/L的CaCl2溶液制备JM109感受态菌；将质粒pBRTM／HCV13011及pGEM3Z克隆载体分别转化JM109感受态菌，筛选阳性菌落，小量制备质粒DNA，经酶切及琼脂糖凝胶电泳 分析 选出含相应质粒的阳性细菌克隆,见图1。