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乙型肝炎病毒X基因区序列系统发育树分析 　 作者：张豪，孙桂菊，钱耕荪，屠红 ［摘要］目的: 研究利用乙型肝炎病毒X基因区序列构建系统发育树进行基因型分析的可靠性。 方法: 从美国NCBI基因库中下载HBV全基因序列共249条，其中166条为已知基因型的序列，83条为未知型序列。利用ClustalX1.8软件和TreeView软件对已知基因型的X区序列构建进化树图，分析由该方法获得的基因型是否与原来的吻合，并对未知型序列进行基因型分析，再用S区的进化树分析加以验证。 结果: 已明确基因型的166条序列利用X基因区序列分析得到的基因型与原先的基因型完全吻合。用X区和S区序列分析方法对83条未知型序列分析的结果是一致的，分别获得A型16条、B型17条、C型27条、D型21条及F型2条，未发现E、G和H型。 结论: 利用乙型肝炎病毒X基因区序列进行基因型分析是完全可靠的，有助于HBV的致病机制研究。 　　［关键词］ 乙型肝炎病毒;基因型;系统发育树;X基因 　　乙型肝炎病毒（HBV）属于嗜肝DNA病毒科，具有双链DNA分子结构，全长大约3.2kb。由于HBV以mRNA为中间体进行逆转录复制，复制过程缺乏校对酶的作用容易发生碱基配对错误，导致HBV基因突变十分频繁。虽然HBV的血清型分型已建立多年，但不能深刻反映HBV病毒的变异，其临床上意义也不大。HBV基因型分型方法以HBV全基因序列核苷酸异源性≥8%为不同基因型的分型标准［1］ ，至今已发现A～H8种基因型。HBV的X基因在致肝病过程中起着至关重要的作用，它与肝癌的发生有着密切的联系。目前还没有利用X基因序列对HBV进行基因型分型的相关报道，作者利用NCBI基因库中的资源，对用X基因序列进行HBV基因分型作一研究。 　　1 材料与方法 　　1.1 HBV基因序列的来源 　　利用互联网络从美国NCBI基因库（http:..）中下载HBV全基因序列249条。这些序列均来源于人类HBV感染者，动物源性的HBV及不常见的双基因型杂合HBV不在本研究之列。 　　1.2 HBV X基因序列的多重比对与系统发育树的构建 　　在完整HBV基因序列中选取X基因序列，以Fas-ta格式导入ClustalX1.8软件中，用多重比对模式进行比较，绘制N.J树，生成ph文件，然后导入TreeView软件来构建系统发育树图，待基因型分析用。 　　1.3 HBV基因型分析 　　分析由已知基因型的166条序列的X区构建的系统发育树，以确定基因分型是否与原来基因库中的基因型一致。以已知基因型别的HBV基因序列为标准，将未知型的基因序列与标准序列一起构建系统发育树，以已知基因型序列在进化树中所处的位置作为分型的依据，来判别其它序列的基因型，从而明确它们归于何种基因型，同时利用国内外广泛使用的S区序列分析加以验证。 　　2 结果 　　2.1 HBV基因序列 　　从NCBI基因库中下载的HBV全基因序列总共249条，经过分析发现其中已知基因型的有166条，分别为A型39条、B型35条、C型34条、D型21条、E型3条、F型30条、G型1条及H型3条。这些序列在NCBI基因库的登记号及基因型别见表1。 　　表1 基因库中已知基因型序列的登记号（略） 　　Tab1 Registered number of the definitive HBV genotype in NCBI 　　 　　2.2 HBV的X基因序列系统发育树分析 　　在下载的HBV全基因序列中选取已明确基因型的序列，利用ClustalX1.8和TreeView两种软件进行X基因序列的系统发育树分析，如图1所示。结果显示，利用X基因序列的系统发育树分析产生的基因型与其在NCBI基因库中登记的基因型完全吻合。另外结果还显示，在NCBI基因库中用各种方法已确定的属于基因型F的基因序列之间存在着较大的异源性，形成两个分支，可能是同属于基因型F的两个亚型。 　　2.3 基因库中未分型序列的进化树分析 　　以已知基因型序列为标准，将83条未知基因型序列与标准序列一起进行X基因的系统发育树分析。分析得出A、B、C、D和F型的序列条数及其基因库的登记号，见表2，未发现E、G和H型的序列。在这83条序列中选出前S.S区完整的序列构建系统发育树得到的基因型与利用X区序列分析的结果是一致的。 　　　3 讨论 　　1988年Okamoto通过对18株不同血清型的HBVDNA全序列比较后发现，血清型不能真正反映HBV基因组的差异，并将全基因序列差异≥8%定为HBV不同的基因型。到目前为止，已经发现了A～H8种不同型别的基因型。HBV基因型的分布具有明显的地域性。A型主要分布于西欧、北欧、北美洲及非洲地区;B型和C型主要分