人41BBL胞外区-抗CD20融合蛋白构建及表达.docVIP

人41BBL胞外区/抗CD20融合蛋白构建及表达 　 作者：刘荣, 姜文国, 刘芳, 张砚君, 范冬梅, 杨铭, 熊冬生, 杨纯正 【摘要】 　　目的: 构建和表达人41BBL胞外区/抗CD20双功能融合蛋白, 并测定该融合蛋白的生物学活性。方法: 采用PCR和ovelap PCR方法构建人41BBL胞外区/抗CD20双功能融合蛋白, 并用双脱氧终止法测定DNA序列; 采用亲和层析法纯化该产物, 并用150 g/L SDSPAGE 和Western blot鉴定纯化产物; 采用FACS法鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性。结果: DNA序列测定结果表明: 人41BBL胞外区/抗CD20双功能融合蛋白已构建成功, 表达可溶性产物的产量达4 mg/L以上, 具有与 Raji细胞(CD20+)和A549（41BB＋）细胞结合的活性。结论: 利用融合蛋白形式, 首次成功地构建了人41BBL胞外区/抗CD20融合蛋白, 并获得较高表达。表达产物具有与相应2个靶抗原结合的活性。 【关键词】 4 1BBL CD20 融合蛋白 免疫治疗 　　［Abstract］ AIM: To construct and express human 41BBL/antiCD20 bispecific fusion protein and identify its biological activity. METHODS: PCR and overlapping PCR were used to construct human 41BBL/antiCD20 bispecific fusion protein. DNA sequencing was performed by the terminus of the fusion protein nucleotide.The product was purified by affinity chromatography and analyzed by Western blot and its antigenbinding activity was examined by FACS. RESULTS: The data of DNA sequence showed that human 41BBL/antiCD20 bispecific fusion protein was correct. The fusion protein was recovered in high yield (up to 4 mg/L) after Etag purification and predominantly(90％) as a dimer. The fusion protein could bind to Raji cells(CD20＋) and A549 cells(41BB＋), respectively. CONCLUSION: The human 41BBL/antiCD20 bispecific fusion protein with high level expression was successfully obtained and could bind to Raji ceIls and A549 cells. 　　［Keywords］41BBL; CD20; fusion frotein; immunotherapy 　　长期以来肿瘤的临床治疗一直受到三大难题的困扰: (1)常规的放、 化疗方案选择性较差; (2)肿瘤细胞产生耐药性; (3)肿瘤发生微小转移。双功能抗体或融合蛋白因其具有同时与肿瘤相关抗原和免疫效应细胞表面分子标记结合, 并能有效地使效应细胞靶向杀灭肿瘤细胞的作用而倍受关注, 最有希望成为解决这些问题的一条新途径。 　　CD20主要表达在前B细胞和成熟B细胞及95%以上的NHL淋巴瘤细胞, 是可以用来作为肿瘤定向免疫治疗的抗原。近来研究的41BB/41BBL信号途径的协同刺激在许多模型系统显示了抗肿瘤效应, 同时应用41BBL和CD3单克隆抗体（mAb）可代替专职抗原提呈细胞的刺激能力, 然而全身性的T细胞激活将导致不需要的临床副作用, 所以CD3/41BB信号必须严格定位在肿瘤位点。为了特异性定向肿瘤细胞和激活肿瘤特异性T细胞, 抗肿瘤免疫性能够被诱导和恢复, 利用双特异抗体针对肿瘤相关抗原与效应细胞相连, 共同作用于肿瘤细胞, 实现肿瘤的靶向治疗［1-3］, 我们已成功构建了抗CD3/抗CD20的diabody表达载体［2］和人41BBL胞外区基因表达载体pAYZ41BBL［4］并证实前者有明显的抑制肿瘤