人bax基因逆转录病毒表达载体构建及其在Hela细胞中表达.docVIP

人bax基因逆转录病毒表达载体构建及其在Hela细胞中表达 　 作者：陈秀军　程玉峰　王来城 【摘要】 　　［目的］构建带有报告基因EGFP的bax基因逆转录病毒表达载体，建立高表达bax基因的Hela细胞。［方法］通过RTPCR方法从Hela细胞克隆bax基因，根据基因工程原理，经PCR、酶切等方法构建bax基因和报告基因EGFP双基因逆转录病毒表达载体pLBaxSNIRES2EGFP，转染Hela细胞后，荧光显微镜和Western Blotting检测bax基因的表达情况。［结果］成功构建了带有EGFP的bax基因的逆转录病毒表达载体，并将其转入Hela细胞。［结论］成功建立的高表达bax基因的Hela细胞株，为探讨bax基因与放射敏感性之间的关系奠定了基础。 【关键词】 bax基因　逆转录病毒表达载体　IRES序列　载体构建 　　Recombinant Human bax Gene Retroviral Vector Construction and Its Expression in Hela Cells Abstrac:［Purpose］To construct the human bax gene retroviral expressive vector with EGFP gene and obtain a Hela strain overexpressing bax gene by transfection. ［Methods］Bax gene was cloned from Hela cell with RTPCR. The retroviral vector carrying both bax and EGFP gene was constructed using PCR and enzyme digestion etc, then this new vector pLBaxSNIRES2EGFP was used to transfect Hela cell to establish a new Hela strain, and the expression of the exogenous bax gene was verified by fluorescence microscope and Western Blotting. ［Results］ The recombinant retroviral vector with exogenous bax and EGFP gene was constructed, and the recombinant vector was transfected into Hela cell. ［Conclusion］ The successful establishment of Hela cell strain that overexpresses exogenous bax gene provides the basis for further studies on the relationship between the bax gene expression and the sensitivity to radiotherapy for Hela cell. Key words: bax gene;retroviral vector;IRES;vector construction 1993年，Oltvai等[1]发现的一种能与Bcl2共沉淀的蛋白质，其分子量为21kD，命名为Bax (Bcl2 associated X protein)，是Bcl2家族的重要的促凋亡蛋白。已有证据表明Bax作为一个重要的促凋亡蛋白，通过对凋亡调节而干预肿瘤发生、发展及预后[2]。另有文献报道，组织或培养的细胞受到放射线照射后，其bax基因表达上调，与其蛋白促进细胞凋亡有关[3]。我们在前期工作中发现，宫颈癌放疗前Bax高表达者的近期疗效优于低表达者[4]，郑建勇等[5]研究表明，bax基因高表达能够增加细胞对DNA损伤性药物阿霉素(adriamycin)的敏感性。因此，bax基因可能与DNA损伤引起的细胞凋亡有某种联系[6，7]，为此，我们采用人宫颈癌细胞Hela细胞系作为体外实验细胞，通过基因工程方法建立高表达bax基因的Hela细胞，旨在探讨其与放射线照射之间的关系。此外，还根据实验需要，将报告基因增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)基因通过内部核糖体结合位点(Internal Ribosome Entry Site，IRES)序列与bax基因串联起来，在同一个PCmv启动子下，启动两个基因的转录和