人CC10基因在肺腺癌A549细胞中表达.docVIP

人CC10基因在肺腺癌A549细胞中表达 　 【关键词】 CC10基因 　　Expression of Human CC10 Gene in Lung Adenocarcinoma A549 Cell 　　Abstract：Objective To construct and identity human the expression plasmid pcDNA3.1hCC10. Methods A 273 bp cDNA fragment was amplified from the total RNA of normal lung tissue by RTPCR,then inserted it into expression vector pcDNA3.1 by DNA recombinant techniques . We transfected pcDNA3.1 hCC10 in A549 cells by liposomemediated gene transfer method. The protein expression of CC10 was detected by the techniques of immunofluorescence and Western blot. Results After the identification of restriction enzymes analysis and sequencing,the recombinant plasmidpcDNA3.1hCC10 was confirmed which contained the correct and entire nucleotide sequence of the CC10 DNA in pcDNA3.1. The expression of CC10 in protein level ascend in A549 cells transfected with reconstructive plasmid. Conclusion The pcDNA3.1hCC10 expression plasmid was successfully constructed, acquired stably protein expression in A549 lung cancer cell line. 　　Key words：CC10;Gene cloning;Gene expression 　　摘要：目的 构建及鉴定人CC10基因真核细胞表达载体。方法 采用RTPCR法，从人肺组织的总RNA中扩增出273bp的人CC10 cDNA片段，利用DNA重组技术将其克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中，脂质体法转染pcDNA3.1hCC10到肺腺癌A549细胞，荧光免疫细胞化学法及Western blot法检测CC10蛋白的表达。结果 用酶切重组质粒并行序列鉴定，人CC10基因已经正确克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中，体外染pcDNA3.1hCC10的肺腺癌A549细胞中CC10蛋白表达明显增高。结论 成功构建了CC10基因的真核细胞表达载体pcDNA3.1hCC10，并获得表达。 　　关键词：CC10;基因克隆;基因表达 　　0 引言 　　CC10是肺clara细胞主要分泌蛋白。过去研究表明CC10与哮喘、慢性阻塞性肺病（COPD）等多种肺部炎性疾病的发生、发展有关[1]。近年来，CC10作为一种新型抑癌基因引起学者们广泛关注[2]。本实验构建CC10基因的真核表达载体，为下一步阐明CC10的抑癌机制提供有益的帮助。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　肺腺癌A549细胞及大肠杆菌DH5α由本实验室保存。CC10多克隆抗体购于美国Biovendor公司，PGEMT.PCR产物回收试剂盒及Lipofection分别为promega、Takara及Invitrogen等公司产品，pcDNA3.1质粒由华中科技大学同济医学院生化实验室保存。 　　1.2 方法 　　1.2.1 总RNA提取 取同济医科大学附属同济医院胸外科手术病人剥离的肺组织100g并剪碎，按RNA抽提试剂盒提取总RNA。 　　1.2.2 人CC10的cDNA合成 以提取的总RNA为模板，加入随机引物oligo(dt)15(0.5mg/ml)、dNTP(10mmoL/L)各1μl, DEPC处理的无菌去离子水7μl，70℃变性10min，随后在MMLV逆转录酶的作用下完成cDNA第一链的合成。以新合成的cDNA为模板，加入上游引物：5’TACACAGTGAGCTTTGGGC3’及下游引物：5ATGAAACTCGC