透明质酸寡糖逆转MCF-7-ADM耐药及促凋亡作用探究.docVIP

透明质酸寡糖逆转MCF?7/ADM耐药及促凋亡作用探究 　 作者：王丽萍　王宝中　司海运　赵春亭　隋振霞 【摘要】 　　［目的］ 研究透明质酸寡糖逆转MCF?7/ADM细胞耐药的作用。［方法］ MTT法研究透明质酸寡糖对MCF?7/ADM耐药逆转作用，流式细胞术测定细胞表面耐药相关蛋白P?gp、MRP的表达及凋亡调控蛋白p53、bcl?2的表达。［结果］ 透明质酸寡糖可提高MCF?7/ADM对化疗药的敏感性，使P?gp、MRP表达下降，p53表达增高。［结论］透明质酸寡糖可部分逆转MCF?7/ADM耐药及促进凋亡的作用。 【关键词】 透明质酸寡糖　MCF?7/ADM　逆转耐药　凋亡 　　肿瘤细胞对化疗药物产生多药耐药性是肿瘤治疗失败的重要原因，克服多药耐药性的方法之一是使用逆转剂[1，2]。目前虽已找到许多逆转多药耐药的药物，但是，或由于效果不够满意，或其毒副作用较大，很难在临床推广。本实验利用人乳腺癌耐阿霉素细胞系，以MTT法、流式细胞术，研究透明质酸寡糖（hyaluronate oligomers，oligo?HA）对耐药细胞的增敏及耐药逆转作用，并从降低膜表面转运蛋白表达，促进耐药细胞凋亡的角度探讨其逆转耐药的机制，以期能寻找到逆转MDR作用强、毒性小的药物。 1 材料与方法 1.1 材 料 乳腺癌MCF?7/S敏感细胞及对阿霉素耐药MCF?7/ADM细胞，源于中国医学科学院天津血液病研究所。细胞培养于IMDM培养液中，含10％胎牛血清，试验用对数生长期细胞。PE?P?gp单抗、PE?MRP单抗、FITC?bcl?2单抗、FITC?p53单抗，均为美国Biosciences Pharmingen产品；oligo?HA（M.W.2500Da）和MTT分别为Seikagaku公司、Sigma公司产品。 EL340i型酶联免疫仪，美国Biotok公司；FACSCaliber型流式细胞仪，美国BD公司。 1.2 方 法 1.2.1 细胞培养及实验分组 取对数生长期的MCF?7／ADM细胞系，均随机分为实验孔和对照孔，各组实验孔和对照孔分别设6个复孔，每组实验重复3次。其中实验孔加入不同浓度（50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml）的透明质酸寡糖（以下均用HA1、HA2和HA3表示）。对照组不加任何试剂或加等体积的培养液。各实验孔细胞均与oligo?HA共培养48h后，收集并进行以下各试验。 1.2.2 oligo?HA对MCF?7／ADM的耐药逆转作用 将上述经oligo?HA作用后的实验组细胞和对照组细胞收集后，以5×104接种于96孔板中，每孔190μl 37℃ 5% CO2、饱和湿度的条件下培养24h，然后加入不同浓度梯度的抗癌药物（另设空白对照孔及调零孔，每浓度设6个复孔）。在培养箱里让细胞与药物作用48h。每孔加入10μ1的MTT，继续培养3h，弃上清，每孔加入DMSO100μl，振荡使甲瞻晶体充分溶解后，用酶标仪(波长490nm)检测OD值；然后计算各组的细胞存活率、死亡率及耐药逆转倍数。 细胞存活率=实验组OD／对照组OD×100％ 细胞死亡率=(1-实验组OD／对照组OD)×100％ 耐药逆转倍数=逆转剂加抗癌药物组细胞死亡率／抗癌药物组细胞死亡率 1.2.3 oligo?HA对细胞内药物积累分析 分别向上述实验孔和对照孔细胞中加入终浓度为10μg／ml的阿霉素。在原细胞培养条件下，继续培养3 h,经流式细胞仪检测细胞内ADM的相对荧光强度。 1.2.4 膜表面耐药相关蛋白P?gp表达测定 收集上述培养的各组实验孔和对照孔细胞并调节浓度为1×106／ml，加入PE标记的P?gp抗体20μl，37℃避光胞膜染色30min，流式细胞仪检测平均荧光强度。 1.2.5 凋亡调控蛋白bcl?2、p53表达测定 细胞培养及实验分组同上，分别加入FITC标记的bcl?2及p53抗体20μl，流式细胞仪检测平均荧光强度。 1.2.6 统计方法 采用SPSSl0．0软件包进行统计学处理。数据用均数±标准差(x±s)表示，计量资料用配对t检验，以Plt;0．05作为显著界限。 　 2 结 果 2.1 oligo?HA增强耐药细胞对阿霉素的敏感性 不同浓度oligo?HA均能明显增加耐药细胞MCF?7/ADM对ADM的敏感性，增加耐药细胞死亡率，与对照组比较差异有显著性(Plt;0．05)，增敏倍数分别为1.48、2.04、1.89;另外，MCF?7/ADM与MCF?7/S 组间各细胞死亡率比较，差异亦均具统计学意义(Plt;0．05) (见表1)。 2.2 oligo?HA增加胞内ADM蓄积 流式细胞仪检测104个耐药细胞内ADM的相对荧光强度，HA1+ADM、HA2+A