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2型糖尿病患者外周血血细胞膜表面组织因子表达及活性探究 　作者：黄细莲 钱申贤 刘利蓉 谭俊峰 施鹏飞 高大泉 谢亚萍 黄细莲 【关键词】 糖尿病；组织因子；血栓形成；单核细胞；血小板 2型糖尿病（T2DM）患者有血栓形成倾向，在血管病变的形成和发展中起着相当重要的作用。新近研究表明，血栓性疾病不仅在组织水平，而且在细胞水平已处于高凝状态〔1〕，组织因子（TF）是凝血过程的始动因子，以往认为主要来源于血管内皮，而现在发现外周血细胞中单核细胞能自身合成的TF，血小板亦含有TF〔2〕，后两种细胞含有的TF在T2DM患者血栓形成中的作用，目前国内外研究不多。本文检测了T2DM患者外周血单核细胞和血小板膜表面TF表达情况及活性，探讨其在DM发病机制中的作用。 　　1 对象与方法 　　1.1 对象 　　按WHO DM诊断标准〔3〕确诊的T2DM患者42例，男26例，女16例，年龄55～78〔平均（61.12±10.41）〕岁。根据白蛋白排泄率将其分为单纯性DM组（DM组，22例）和DM合并微血管病变组（DN组，20例）。正常对照22例，男性12例，女性10例，年龄56～77岁〔平均（63.52±11.21）〕岁，排除了血栓性疾病及抽血2 w前使用过阿司匹林、肝素等抗凝药物者。 　　1.2 方法 　　流式细胞仪型号:FACS Calibur，美国 BectonDickinson 公司,CD62PPE-Cy5、CD61-PE、CD14PE以及同型对照IgG2a均购自BD Pharmingen公司。TFFITC 同型对照IgG1及Spectrozyme FXa购自American Diagnostica Inc。因子Ⅶa和因子Ⅹ购自上海船夫生物科技有限公司。①标本准备 单核细胞荧光标记技术：取Falcon管若干支顺序编号，每管加入枸橼酸钠抗凝外周血100 μl及CD14PE、TFFITC单克隆抗体10 μl,另外在对照管中加入同型对照抗体，低速涡流混匀后室温下避光孵育20 min，加入FACS Lysing Solution(1×)溶血素2 ml，混匀后室温暗处反应6～10 min,1 500 r/min离心5 min，弃上清液；加生理盐水2 ml，低速涡流混匀后1 500 r/min离心5 min，弃上清液，加1%多聚甲醛液500 μl，低速涡流混匀后上机检测。血小板荧光标记技术：取Falcon管若干支顺序编号，每管加入枸橼酸钠抗凝外周血5 μl及TF FITC、CD62PPECy5、CD61PE单克隆抗体各10 μl，另外在对照管中加入同型对照抗体，低速涡流混匀后室温下避光孵育20 min，加1%多聚甲醛液500 μl，低速涡流混匀避光保存30 min以上，24 h内上机检测。②单核细胞膜表面TF活性的测定：外周血单个核细胞（MNC）包括单核细胞和淋巴细胞，但淋巴细胞不表达TF，可采用MNC来研究单核细胞TF活性，MNC分离采用密度梯度法，肝素抗凝血经Hank氏液稀释，加入装有淋巴细胞分离液的试管中，2 000 r/min离心30 min,用毛细吸管吸出MNC，显微镜下确定单核细胞百分率，调单核细胞浓度为3×104/ml。根据TF/Ⅶa复合物可以使因子Ⅹ转变为活化因子Ⅹa的原理，利用发色底物Spectrozyme FXa，测定反应体系因子Ⅹa的生成量，判断单核细胞表面TF活性。在体外分离培养的血液单核细胞（2×104/孔），用HEPES缓冲液〔含CaCl2(5 mmol/L)0.1%BSA〕洗涤细胞2次，分别加入因子Ⅶa (100 pmol/L)和因子X（135 nmol/L），37℃孵育30 min，最后在反应体系中加入Spectrozyme FXa（0.5 mmol/L）底物，以405 nm波长测定反应物的吸光度，换算成FXa生成量（nmol/L）。FXa的生成量与单核细胞表面TF活性成正比。血小板膜表面TF活性的测定：外周血用ACD抗凝，经1 000 r/min离心10 min获得富血小板血浆，用PBS调血小板浓度为2×109/ml，利用发色底物法测定FXa生成，方法同上。 　　1.3 统计学分析 　　数据以x±s表示，采用SPSS11.0软件，组间比较采用t检验。 　　2 结 果 　　2.1 T2DM患者单核细胞和血小板膜表面TF的表达 　　正常对照组血小板膜表面CD62P、TF阳性表达率及单核细胞膜表面TF表达率很低，而DM患者均明显增高（P＜0.01），而DN组较DM组明显增高（P＜0.05），见表1。表1 T2DM患者单核细胞和血小板膜表面TF的表达（略) 　　　2.2 T2DM患者单核细胞和血小板膜表面TF的活性 　　正常对照组血小板及单核细胞膜表面TF活性很低，而DM组较正常对照明显增高（P＜0.01