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大鼠皮层神经元原代培养、鉴定及氧糖剥夺模型建立 　 作者：莽靖 李昕华 阎世军 何金婷 邢影 邵延坤 徐忠信 【摘要】 目的 原代培养和鉴定大鼠皮层神经元，并建立大鼠皮层神经元氧糖剥夺（OGD）模型。方法 采用酶消化法和机械分离法相结合进行大鼠神经元原代培养，采用抗NSE免疫细胞化学染色鉴定，应用缺氧DHank液及缺氧培养罐行OGD，台盼蓝染色及LDH漏出率检测细胞损伤程度。 结果 神经元培养至第6天，NSE染色阳性细胞为86.32%±2.64%；神经元经不同时长的OGD处理后，台盼蓝染色呈现不同形态；OGD 60 min时，神经元LDH漏出率较对照组明显增加（Plt;0.05）。结论 成功完成大鼠皮质神经元原代培养，神经元在培养第6天可用于模型制备，成功建立神经元OGD模型。 【关键词】 神经元；原代培养；氧糖剥夺 　　体外细胞培养是神经科学研究重要的方法。中枢神经系统对缺血缺氧极其敏感，缺血缺氧性脑损伤是缺血性脑血管病的基础病理过程〔1～3〕。本实验采用大鼠皮层神经元原代培养，应用体外氧糖剥夺（oxygenglucose deprivation，OGD）建立大鼠脑皮层神经元缺血缺氧损伤模型，模拟体内脑缺血过程，对进一步探讨缺血缺氧过程中神经元的病理及病理生理变化，研究其脑损伤的机制，探索新的治疗靶点具有重要意义。 　　1 材料与方法 　　1.1 大鼠皮层神经元原代培养 　　出生12 h内的Wistar乳鼠，用于皮层神经元原代培养。购自吉林大学动物实验中心。采用酶消化法和机械分离法相结合培养神经元。分离出Wistar鼠皮层组织，剪碎后加入0.125%的胰酶，在37℃，5％CO2培养箱消化、震荡，形成细胞悬液后接种培养，6 d后进行鉴定。 　　1.2 大鼠皮层神经元鉴定 　　①细胞培养板每日置于倒置显微镜下观察细胞胞体与突起形态、贴壁与生长情况。②神经元在培养第6天用特异性烯醇化酶（NSE）免疫细胞化学染色进行鉴定，显微镜下观察，以在细胞膜和胞浆内出现棕黄色颗粒者判定为阳性，每张爬片随机选取3个200倍视野，计数，取均值，计算阳性细胞百分比。 　　1.3 体外培养神经元OGD模型的建立 　　①缺氧DHank液制备。利用自行设计生产的组装瓶将DHank液通入含95%N2及5%CO2的缺氧气体，制备缺氧DHank液，用血气分析仪测定缺氧DHank液的氧浓度。②缺氧罐的制作及应用。将真空干燥器通入缺氧气体制成缺氧罐，用麻醉气体分析仪测定缺氧罐内氧含量。③神经细胞OGD模型的建立。将培养第6天的神经元用缺氧DHank液孵育，并放入缺氧罐中，将缺氧罐放入37℃孵箱内开始计时；分别取缺氧时间为15、30、45、60、90、120、180 min再复氧24 h的神经元进行评价。 　　1.4 体外培养神经元OGD模型的评价 　　①台盼蓝染色法测定细胞死亡率。测定时取出培养板，每个时间点取3孔，吸弃上清液，然后加一滴 0.4%台盼蓝溶液，在3 min内随机计数200个细胞中蓝染的死细胞及未蓝染活细胞的细胞数，计算细胞死亡率。②LDH漏出率的检测。将待测细胞培养板取出，每组每个时间点取3孔，吸取各孔内的培养液入相应试管内，加入等量PBS 液，制备成细胞匀浆液，收集入相应的试管内。每孔液体设2个试管，分别测定细胞培养液和细胞匀浆液的OD值。按公式计算LDH漏出率。 　　　1.5 统计学处理 　　数据以x±s表示，应用SPSS16.0软件进行方差分析。 　　2 结果 　　2.1 大鼠皮层神经元原代培养及鉴定 　　神经元在培养第6天分化成熟，可见细胞散在生长，胞体小，折光性强，形成密集的神经细胞网络。培养第6天，可见大部分细胞染成棕黄色，NSE阳性细胞占全部细胞的百分比的86.32%±2.64%，见图1。 　　2.2 缺氧DHank液体氧浓度及缺氧罐氧含量 　　缺氧DHank液体的氧浓度低于1%，缺氧罐内氧含量为1%±0.1%，二氧化碳浓度为5%±0.1%。 　　2.3 神经元不同OGD时间细胞死亡率 　　神经元OGD 15、30 min，所有细胞均未受损伤；45、60 min少部分神经元蓝染，细胞死亡率为15.00%±2.50%、22.17%±1.04%；90、120 min使神经元出现皱缩，胞浆空泡明显，突起缩短、断裂，胞浆空泡明显，蓝染细胞增多，细胞死亡率为40.67%±2.08%、56.00%±2.17%；180 min使神经元轮廓模糊，全部蓝染，细胞死亡率为97.17%±1.89%。 　　2.4 LDH漏出率检测 　　随OGD时间增加，神经元LDH漏出率逐渐增加，其中神经元OGD 45 min时LDH漏出率开始明显增加（Plt;0.05）。见图2。 　　3 讨论 　　体外细胞培养已被广泛应用于神经细胞分子生物学研究。本