益气解毒法对大鼠干细胞系WB-F344作用机制的研究.pdfVIP

中 文摘要 目的 研究具有益气解毒功效的牛黄参(牛黄、西洋参)含药血清对大鼠肝 干细胞系WB-F344的增殖、凋亡及分化过程中相关细胞因子及受体表达的 影响，探讨益气解毒法对肝干细胞的作用机制，以便从分子生物学水平来 阐释益气解毒法治疗慢性肝病的作用原理，为进一步研究治则治法提供新 的思路，也为临床推广应用提供理论与实验依据。 方法 1．含药血清的制备：体外培育牛黄、西洋参配伍组采用传统水煎法灌 胃动物制作含药血清(简称水煎组)；依据现代药理药效研究，提取西洋 参中具有抗疲劳作用的西洋参皂甙，总皂甙类成分，提取体外培育牛黄中 具有保护肝细胞、恢复肝功能、利胆退黄作用的胆红素、胆酸、去氧胆酸、 牛磺酸类成分制成牛黄参胶囊，后胶囊取粉稀释使用灌胃动物制作含药血 清(简称成分组)。水煎组和成分组在实验中互为对照组。将大鼠分为空 白组、水煎组、成分组，每组各16只。各组给相应的药物连续灌胃7天 (1次／d)，给药浓度为：含牛黄生药浓度3．69／L，含西洋参生药浓度 21．69／L，大鼠按体重1009灌胃lmL的量给药，空白组灌胃等量的生理盐 水，连续一周。末次给药后2h进行大鼠颈动脉取血，将采集的血液在室 除菌，分装成小瓶于-20C保存备用，需要时用培养液配制成所需浓度的 含药血清。 基中，细胞浓度为2×104个／mL，置于5％C0：、37C的培养箱中培养。细 胞换液时间为2-3天，3-5天传代，O．25％胰蛋白酶消化后1：2传代。 3．益气解毒法对wB—F344增殖的影响：取对数生长期细胞用胰酶消 养24h后，分别加入浓度为5％、10％、20％的成分组与水煎组药物血清， 空白对照组加入相同浓度梯度的正常大鼠血清，正常对照组则加入等量的 培养液，正常培养基培养。各组血清作用24h后，采用四甲基偶氮唑盐(MTT) 比色法测定细胞的增殖状况，选取增殖的最佳药物血清浓度，后续实验均 以此浓度进行研究。 4．益气解毒法对wB—F344 zR 0％胎牛血清)、空白对照组(1 表达的影响：血清分为正常对照组(1 o％正常大 鼠血清)、成分组(10％成分剂血清)、水煎组(10％水煎剂血清)，各组血清 作用细胞24h后，裂解细胞，提取细胞的总蛋白，蛋白印迹法 lR和 TGF-D：R的表达情况。 5．益气解毒法对WB-F344 地塞米松1pmol／L)，加入10％成分组和水煎组的含药血清，并设立正常 和空白血清对照孔，前者加入正常培养液，后者加入1o％正常大鼠血清。 志物白蛋白(ALB)的mRNA表达量，实验过程中注意观察含药血清刺激后细 胞形态的变化。 06／mL，置 6．益气解毒法对WB-F344凋亡的影响：调整细胞密度为lxl 因子D，再分别加入各组血清干预，血清仍分为正常对照组(10％胎牛血 清)、空白对照组(10％正常大鼠血清)、成分组(10％成分剂血清)、水煎组 细胞仪测定并分析数据。 结果 II 清成分组和水煎组均能促进WB-F344细胞的增殖，与空白、正常对照组比 药血清均未表现出对细胞的毒性作用，镜下观察各组细胞生长良好。 2．益气解毒法对WB-F344 表达的影响：经10％牛黄参含药血清成分组和水煎组干预后，WB-F344细胞 3．益气解毒法对WB-F344 参含药血清成分组和水煎组干预后，WB-F344肝干细胞表面标志物AFP mRNA的表达量在细胞分化过程中随着时间的延长逐渐减少，肝细胞表面 标志物ALB (PO．05)。 4．益气解毒法对WB-F344凋亡的影响：经10％牛黄参含药血清成分组 和水煎组干预后，WB-F344细胞的凋亡率与空白、正常对照组相比显著下 降(P0．01)，且成分组优于水煎组(P0．05)。