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大黄素影响钙敏感性调节机制探究 　【摘要】 目的 研究大黄素对G蛋白耦联的钙敏感性调节影响的机制。方法 用酶解法分离大鼠胃平滑肌细胞，采用钙钳制技术控制平滑肌细胞内游离钙离子水平。 用图像分析系统测量平滑肌细胞长度。采用激光扫描共聚焦显微镜和免疫荧光技术分析RhoA在细胞内的时空分布变化。结果 大黄素在平滑肌细胞内游离钙离子水平固定时剂量依赖性收缩细胞。G蛋白降解产物GDP类似物GDPβs剂量依赖性对抗大黄素收缩胃平滑肌细胞作用。 C3-transferase（RhoA抑制剂）抑制大黄素引起的细胞收缩，大黄素可引起RhoA膜移位。 结论 大黄素对G蛋白耦联的钙敏感性调节有影响，并且是通过RhoA途径。 【关键词】 大黄素 胃平滑肌细胞 钙敏感性 【Abstract】 Objective It has been noted that emodin can influence calcium sensibitity but its precise mechanism remains unsolved.To investigate how emodin influence calcium sensibitity.Methods Cells were isolated from the muscle layers of Wistar rat stomach by enzymatic digestion. Intracellular free calcium ions level of smooth muscle cell was controlled by the technique of calcium claw cell length was measured by computerized image micrometry. RhoA distribution at rest state or after stimulation was measured with immuoflurescence confocal microscopy.Conclusion Emodin can influence calcium sensibitity by the approach of RhoA route. 【Key words】 emodim;gastric smooth muscle cell;calcium sensibility 目前的研究表明平滑肌细胞的收缩机制为：（1）［Ca2+］i的升高：钙升高后，通过肌球蛋白轻链激酶（MLCK）途径磷酸化肌球蛋白轻链（MLC20）引发收缩。（2）钙敏感性的升高：这一机制是通过抑制肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP）的活性来实现的［1］。钙敏感性的增加使得在相同的［Ca2+］i浓度条件下，细胞可以产生更大的收缩力。调节钙敏感性的信号转导途径被认为是：激动剂通过G蛋白耦联受体激活RhoA（一种22-26-kDa的small GTPase），随之激活其下游的激酶ROK（RhoA kinase），磷酸化MLCP的调节亚单位，从而抑制MLCP的活性抑制MLC20脱磷酸化［2］。 大黄（Rhubarb）是通里攻下中药中的代表性药物，具有明确增强肠道蠕动的作用，被广泛用于急腹症的治疗中。大黄素是大黄的重要有效成分，为蒽醌类化合物，具有多种药理作用。Cheng等人的研究发现大黄素通过升高［Ca2+］i促进大鼠膈肌的收缩。林秀珍等研究表明大黄素可以促进离体肠道平滑肌条的收缩，杨文修等证实大黄素可促进细胞膜去极化，缩短膜电位振荡周期，增加峰电位发放频率，增加分节律收缩的幅值指数。 我们在之前的研究中已证实大黄素对大鼠胃平滑肌细胞有收缩作用，并也证实能够影响［Ca2+］i，但是否影响钙敏感性尚未证实，本实验将初步解决这一问题。 1 材料与方法 1.1 实验材料和仪器 健康成年Wistar大鼠（天津市医学实验动物中心提供），清洁级，雌雄各半，鼠龄3～4个月，体重（205±25）g，Emodin、GDPβs、GTPγs、C3-transferase、β-escin、DMEM（sigma）,一抗 mouse monoclonal anti-RhoA IgG（SANTA CRUZ）,二抗、抗体稀释液、Triton-100、多聚甲醛（北京中山生物公司），余试剂均为国产分析纯。Bio-rad Radiance2000型激光扫描共聚焦显微镜，超净工作台，细胞培养箱，Olympus倒置显微镜，Cmais2000图像分析系统，Naro超纯水系统。 1.2 实验方法 1.2.1 胃平滑肌细胞的分离 大鼠禁食2天,脱颈处死, 无菌操作取胃, 生理盐水彻底冲净, 刮去黏膜，将肌肉组织剪成约1～2mm3体积大小，放于15