弓形虫p30Rop2复合基因大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒构建.docVIP

弓形虫p30Rop2复合基因大肠杆菌/分枝杆菌穿梭质粒构建 　 作者：程鹏，张佃波，王海防，公茂庆 【摘要】 目的：构建弓形虫p30Rop2复合基因大肠杆菌/分枝杆菌穿梭表达质粒。方法：利用PCR技术从已构建的pET30p30Rop2质粒扩增p30Rop2复合基因片段，亚克隆于大肠杆菌/分枝杆菌穿梭质粒pSTM3，构建重组质粒pSTM3p30Rop2，并进行双酶切鉴定和测序分析。结果：成功构建pSTM3p30Rop2重组穿梭表达载体，测序结果发现有一个碱基发生突变，但没有改变开放阅读框。结论：pSTM3p30Rop2穿梭质粒的成功构建为弓形虫分枝杆菌疫苗的研制提供了前提条件。 【关键词】 弓形虫;p30Rop2复合基因；穿梭表达载体 　　弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种世界性分布的专性胞内寄生原虫，能引起人兽共患的弓形虫病。全世界约有1/3的成年人感染弓形虫，但多为隐性感染。我国人群的感染率约在5％～20％，平均为8.5%。孕妇感染弓形虫后，常可通过胎盘将弓形虫传给胎儿，可导致流产、畸胎、死胎等，而在AIDS患者等免疫功能严重受损者，弓形虫是引发致死性病变的主要病原之一［1］。由于弓形虫寄生生活的复杂性、形态的多变性，仅利用某一时期、某一形态的单一抗原制备的单价疫苗，远远不能激发全方位的宿主抗寄生虫免疫反应，难以达到理想的抗虫目的。 本研究将弓形虫主要表面抗原p30和棒状体蛋白Rop2候选抗原基因克隆到大肠埃希菌分枝杆菌穿梭表达载体pSTM3中，构建重组pSTM3p30Rop2质粒，为弓形虫分枝杆菌疫苗的研制提供了前提条件。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 质粒和菌株 重组克隆质粒pET30p30 Rop2、穿梭表达质粒pSTM3和大肠杆菌DH5α均为本单位实验室保存。 　　1.1.2 主要试剂 TaqDNA聚合酶、dNTP、Hind III、T4DNA连接酶,均为Promega公司；DNA纯化试剂盒（QIAquick）,质粒抽提试剂盒（QIA prep Spin Miniprep kit）均为QIAGEN公司产品。EcoRⅤ 为Fermentas公司产品；TOPO克隆试剂盒为Invitrogen公司产品。 　　 　　1.1.3 引物的设计与合成 根据GenBank提供的序列，分别设计p30基因的上引物和Rop2基因的下引物。在上引物5′端引入EcoRⅤ酶切位点，下引物3′引入HindⅢ酶切位点，并分别在NCBI进行BLASTEN查看引物的特异性，并用Oligo软件进行评分,引物序列为： 　　P1 5’ACGATATCAAGGAGATATACCATGTTCACTC 　　TCAAGTGCC3’; 　　P2 5’ATAAGCTTTCATGCCGGTTCTCCATCAG3’，由上海生工生物技术有限公司合成。 　　1.2 方法 　　1.2.1 目的基因p30Rop2的PCR扩增 提取pET30p30Rop2质粒，作为模板，反应条件：预变性94℃ 2 min；94 1 min；55℃ 45 s，72℃ 3 min，30个循环；最后延伸72℃ 15 min。扩增产物约为1 900 bp，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。 　　1.2.2 扩增片段的TOPOTA克隆和测序 将PCR产物进行跑胶回收后，建立6 μl连接体系：PCR产物3 μl、salt solution 2 μl、TOPO vector 1 μl,16℃ 4 h,将连接产物全量转化200 μl DH5α感受态，PCR法鉴定阳性重组子，并提取质粒酶切鉴定后送公司测序。 　　1.2.3 穿梭表达载体pSTM3p30Rop2的构建 将TOPOp30Rop2质粒和pSTM3空质粒同时双酶切，回收目的基因片段和载体大片段。建立如下连接体系：目的基因6 μl、载体大片段2 μl、T4DNA连接酶1 μl、Buffer 1 μl；16℃ 3 h。将连接产物全量转化200 μl DH5α感受态，PCR法鉴定阳性重组子，并提取质粒酶切鉴定。 　　　2 结果 　　2.1 目的基因的体外扩增 p30Rop2复合基因PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后,约在1 900 bp处见到明显的扩增产物条带,未见非特异扩增条带,与理论扩增产物长度吻合(图1)。 　　2.2 TOPOTA克隆载体的鉴定 提取PCR阳性菌提取质粒后用EcoRⅤ和HindIII双酶切，得到的基因片段大小与预测值一致。测序结果与GenBank报道的序列进行比对后发现有三个碱基发生突变，其中两个不改变氨基酸的性质，Rop2基因的174位氨基酸密码子由CCT突变为CTT，编码氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸，见图2。 　　2.3 重组质粒pSTM3