抗纤灵冲剂对大鼠体外肾系膜细胞增殖及分泌ECM影响探究.docVIP

抗纤灵冲剂对大鼠体外肾系膜细胞增殖及分泌ECM影响探究 　【关键词】 细胞增殖 　　我们以前的研究证明，中医抗纤灵冲剂对慢性肾功能衰竭（CRF）［1］患者及实验性慢性CRF大鼠肾脏功能和结构损害有明显的改善作用［2］，但作用机制尚不清楚，近年来研究表明，肾系膜细胞（MC）、细胞外基质（ECM）及各种细胞因子、生长因子在肾功能进行性减退过程中起着重要作用［3］。本研究采用血清药理学方法和MC体外培养技术，观察了抗纤灵冲剂对大鼠肾系膜细胞增殖和ECM的主要成分纤维联结蛋白（FN）、Ⅳ型胶原（C-Ⅳ）的影响，并与西医血管紧张素转换酶抑制剂蒙诺做对照，以期从细胞水平探讨抗纤灵冲剂防治CRF的作用机制，发展中医药防治CRF的理论认识，为进一步提高CRF的中医药诊治水平提供依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 抗纤灵冲剂（KXL）由丹参、大黄、牛膝、桃仁、当归组成，由上海中医药大学附属曙光医院提供，每袋含生药9g；肾组织来源为上海必凯实验动物中心提供的SD大鼠的肾组织，体重为（150±20）g，大鼠肾小球系膜细胞株由长征医院肾科提供（第54代）。对照西药为血管紧张素转换酶抑制剂蒙诺（福辛普利），每粒10mg，由上海中美施贵宝公司提供。定量测定人血清Ⅳ型胶原试剂盒，由中美合资上海华泰生物工程有限公司提供。FM免疫比浊法定量试剂盒：由上海玉兰生物技术研究所提供。培养条件：37℃、5%CO2。RPMI-1640培养基为美国GIBCO产品。胎牛血清（FCS）由上海第二医科大学提供，56℃水浴30min灭活分装，于-20℃冰箱保存备用。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 动物分组 SD雄性大鼠56只，每组8只，用Platt法5/6肾切除做大鼠慢性肾衰模型，分两期完成，先背部切口切除左肾2/3，1周后切除整个右肾。假手术组仅背部切口分两次剥离左右肾包膜，保留肾上腺，根据手术后2周所测血肌酐值分组，造模组及治疗组大鼠经统计学处理，使分组后各组血肌酐、尿素氮值无明显差异。分为7组，假手术组（A）；假手术加抗纤灵组（B）；模型组（C）；西药蒙诺对照组（D）；抗纤灵组（E）、丹参组（F）、大黄组（G），A、C组用自来水灌胃3ml/d，B、D、E、F、G组按成人常规用量的20倍给药，3ml/d灌胃，实验共进行30天，在最后一次灌胃2h后腹腔静脉无菌采血6ml，分离血清，56℃水浴30min灭活后分装，于-20℃冰箱保存备用。 　　1.2.2 体外培养的大鼠肾系膜细胞（MC）的方法 将从液氮中取出的冻存MC按细胞复苏法复苏，传代3次，按MC传代法经胰蛋白酶消化后收集于胰心管内用含20%FCS的1640培养液配成3×104ml细胞悬液，接种于96孔板，每孔100μl，培养箱中孵育24h后弃去培养液，换1640液继续培养24h，使大部分细胞静止于G期，弃去培养液，然后8孔1组，分别加入含A~G组10%和20%血清的1640培养液（由于条件原因10%B组5孔，20%B组6孔），继续培养72h后，每孔加入噻唑蓝（MTT）溶液（5mg/ml）10μl，37℃继续孵育4h终止培养，弃去培养液72h后，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μl，振荡10min。于酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值（选择波长492nm）。 　　1.2.3 测定大鼠肾系膜细胞分泌细胞外基质、纤联蛋白、Ⅳ型胶原的方法 将复苏后传代3次的MC按传代法经胰蛋白酶消化后收集于离心管内，用含20%FCS的1640培养液配成6×104ml悬液转种至24孔板，每孔500μl，继续培养24h，弃去上清，每孔加入含0.5%FCS的1640培养液500μl，继续培养24h，使细胞生长同步。弃去上清，含10%、20%血清的1640培养液A组各5孔，B组各7孔，C组各5孔，D、E组各10%7孔、20%8孔，每孔500μl。培养72h后弃去上清，加入含0.5%FCS的培养液每孔1ml，培养24h，吸取上清，测定纤联蛋白、Ⅳ型胶原含量。 　　2 结果 　　2.1 抗纤灵方对MC增殖的影响 与A组比较差异有显著性（P＜0.05），说明肾衰血清能明显刺激系膜细胞增殖。与C组比较差异有显著性（P＜0.05），说明抗纤灵方及其组方单味药丹参、制大黄能减轻肾衰血清对系膜细胞的刺激，明显抑制系膜细胞增殖，并呈浓度依赖性。蒙诺与抗纤灵作用相似。见表1。 　　表1 抗纤灵对离体大鼠系膜细胞的增殖的影响 （略） 　　2.2 抗纤灵对大鼠肾系膜细胞分泌细胞外基质的影响 见表2。 　　表2 抗纤灵对大鼠肾系膜细胞分泌细胞外基质的影响 （略） 表2中数据说明肾衰大鼠血清能刺激肾系膜细胞分泌Ⅳ型胶原、纤联蛋白，而且与浓度呈正比。提示肾衰大鼠血清对肾系膜细胞分泌Ⅳ型胶原的刺激作用有随浓度的增高而增高的趋势；而假手术大鼠含药血清组（B组）