人AK3基因在哺乳动物细胞系中的表达与定位.pdfVIP

UniversitatisMedicinalisAnhui2014 安徽医科大学学报Acta Nov；49(11) ·1531· 人AK3基因在哺乳动物细胞系中的表达与定位 李克娟，顾或，刘晓颖，范礼斌 摘要目的运用基因克隆技术构建带FLAG标签的腺苷 酸激酶3(AK3)真核表达载体，观察其在哺乳动物细胞内的 在哺乳动物细胞内的表达及定位情况。 定位和表达情况。方法以人AK3全长的cDNA序列的菌 1材料与方法 液为模板，设计带有FLAG标签的引物，用PCR方法构建出 真核表达载体pcDNA3．1一AK3一FLAG。运用免疫荧光及 1．1质粒、菌株和细胞包含AI(3全长eDNA序 Western blot法检测其在哺乳动物细胞中的定位与表达情 列的菌液是由厦门大学韩家淮院士实验室提供，经 况。结果成功构建了pcDNA3．1．AK3一FLAG质粒；荧光定 摇菌抽提后得到质粒；pcDNA3．1表达载体、TGl的 位试验表明AK3在COS7细胞的胞质中呈斑点状分布，细胞 菌株，以及HEK-293T细胞、COS7细胞均由安徽医 核中未见明显分布；Westernblot法检测表明AK3在HEK- 293T细胞中能有效表达。结论AK3在哺乳动物细胞内能科大学细胞生物学教研室实验室保存。 够有效表达和定位，为进一步研究AK3和其他蛋白之间的 1．2主要试剂与仪器实验所用的各种限制性内 相互作用奠定了基础。 DNA连 切酶、pfu酶赡于加拿大Fermentas公司；T4 关键词AI(3；细胞定位；免疫荧光 接酶、小牛肠碱性磷酸酶、质粒小量抽提纯化试剂 394，2 中图分类号R341；R 盒、胶回收(小量)试剂盒购于德国Qiagen公司； 1—153l一04 文献标志码A文章编号1000—1492(2014)1 DMEM培养基、小牛血清分别购于美国Gibco公司 腺苷酸激酶(adenylatyekinase，AK)催化ATP 公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG购于 或GTP的1一磷酸基团转到AMP的p一位，产生两分 北京中杉金桥生物技术有限公司；DNAMarker、蛋 子的ADP，参与细胞的能量代谢…。目前，人类细 胞中至少发现了9种AK异构体，即从AKl到AK9。 DMI 司；荧光显微镜(Leica6000型)购于德国Leica AK3最初是利用凝胶柱层析的方法从牛心脏的线 公司。引物由Invitrogen(上海)和上海生工生物有 粒体中分离纯化并鉴定的心J，随后克隆了该基因的 限公司合成。 全长eDNA序列¨】。用AK3的eDNA序列作为探 1．3方法 针所完成的Northern杂交实验H。1表明，AK3分布