分子生物学大实验 (2).pptxVIP

分子生物学大实验生物技术专业2010年08月;课程特点：;课程要求：;分子生物学主要技术;实验操作内容 实验准备：药品配制及培养基制备 实验1：植物总DNA的提取 实验2：质粒DNA的连接、转化与筛选 实验3：质粒DNA的提取及酶切检测 实验4：PCR 实验5：琼脂糖凝胶电泳（在实验1、3、4中进行）;实验一：琼脂糖凝胶电泳;一、琼脂糖和琼脂糖凝胶： 琼脂糖是D-和L-半乳糖残基通过α（1→3）和（1 → 4）糖苷键交替构成的线状聚合物。 琼脂糖凝胶可以构成一个直径从50nm到略大于200nm的三维筛孔的通道。;二、下述因素决定DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率： DNA分子大小： 双链DNA分子在凝胶中迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比。分子越大，迁移越慢。 琼脂糖浓度： 给定大小的线状DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。浓度越高，迁移越慢。;DNA构象： 超螺旋环状、切口环状和线状DNA在琼脂糖凝胶中以不同速率迁移。（主要取决于琼脂糖凝胶的浓度和类型，还有电流强度、缓冲液离子强度和超螺旋程度） 大多数情况，主要区别未处理的环状DNA样品和单一位点经限制酶作用线状化的同一DNA样品。 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭： 溴化乙锭插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加，因此，线状DNA-染料复合物在凝胶中的迁移率约降低15%。 所用电压： 低电压时，DNA片段迁移率与所用电压成正比。;琼脂糖种类：见表1 电泳缓冲液： DNA的泳动受电泳缓冲液组成和离子强度的影响。 适用于天然双链DNA的电泳： TAE buffer（E buffer） TPE buffer TBE buffer ;表1 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围;三、凝胶载样缓冲液（loading buffer）： 临上样前将样品和loading buffer进行混合。 loading buffer作用： 1、增加样品密度，以保证DNA沉入加样孔内； 2、使样品带有颜色，简化上样过程； 3、其中的染料（溴酚蓝、二甲苯氰FF）在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移，这一特性与琼脂糖浓度无关。;实验目的：;DNA分子在碱性环境中（pH8.3 buffer）带负电荷，在外加电场作用下，向正极泳动。不同的DNA片段由于其分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率不同，从而可以区分不同的区带。电泳后经溴乙锭（E.B.）染色，在波长254nm紫外光照射下，DNA显橙红色荧光。溴乙锭检测DNA灵敏度很高，10ng或更少的DNA即可检出。 线性DNA在凝胶中迁移距离（迁移率）与它的分子量大小的对数成正比。将未知大小DNA的迁移距离与已知分子大小的DNA标准物（DNA Marker）的电泳迁移距离进行比较，即可计算出未知DNA片段的大小。;1、用胶带或插板封住塑料托盘开放的两边形成一个模具，置于水平工作台上，将梳子插入模具，梳子距模具一端约1cm，梳齿底端距托盘表面保持0.5-1mm的间隙。 2、称取0.4g琼脂糖置于三角瓶中,加入40ml TAE buffer以配制1%的凝胶，使用电炉子加热直至琼脂糖完全熔化，期间轻轻摇匀。 3、待琼脂糖冷却至65℃左右(滴入E.B. 至终浓度为0.5μg/ml，轻轻摇匀，避免产生气泡)，小心缓慢倒入模具内（避免产生气泡），使凝胶缓慢展开直至在托板表面形成一层约3mm厚的均匀胶层，室温下静置0.5-1h。;4、待凝固完全后，双手均匀用力轻轻拔出梳子（注意切勿使样品槽破裂），在胶板上形成相互隔开的样品槽。 5、将凝胶连同托板放入电泳槽平台上，倒入适量TAE buffer直至浸没过胶面2-3mm，小心除去样品槽中的气泡。 6、用微量加样器取样品（或DNA Marker）20ul，取6×loading buffer 5ul，与样品（或DNA Marker）缓慢混合均匀（避免气泡），将混合样加入样品槽内（注意避免因样品过多而溢出，污染邻近样品）。 7、加入样品后，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极，接通电源，开始电泳，在样品进胶前可用略高电压，防止样品扩散，样品进胶后，应控制电压不高于5V/cm（电压值V/电泳槽两极之间距离cm）。;8、当染料条带移动到距离凝胶前沿约1cm时，停止电泳。 9、将电泳后的胶板小心推至含0.5ug/mlE.B.染色液中，室温下浸泡染色30min（略）。 E.B.是诱变剂，强致癌物质，配制和使用时应带一次性手套，不要将该溶液洒到桌面或地面上，凡是E.B.污染过的器皿或物品，单独放置，必须经专门处理后，才能进行清洗或弃去。 10、小心取出凝胶