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分子生物学大实验生物技术专业2010年08月;课程特点:;课程要求:;分子生物学主要技术;实验操作内容
实验准备:药品配制及培养基制备
实验1:植物总DNA的提取
实验2:质粒DNA的连接、转化与筛选
实验3:质粒DNA的提取及酶切检测
实验4:PCR
实验5:琼脂糖凝胶电泳(在实验1、3、4中进行);实验一:琼脂糖凝胶电泳;一、琼脂糖和琼脂糖凝胶:
琼脂糖是D-和L-半乳糖残基通过α(1→3)和(1 → 4)糖苷键交替构成的线状聚合物。
琼脂糖凝胶可以构成一个直径从50nm到略大于200nm的三维筛孔的通道。;二、下述因素决定DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率:
DNA分子大小:
双链DNA分子在凝胶中迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比。分子越大,迁移越慢。
琼脂糖浓度:
给定大小的线状DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。浓度越高,迁移越慢。;DNA构象:
超螺旋环状、切口环状和线状DNA在琼脂糖凝胶中以不同速率迁移。(主要取决于琼脂糖凝胶的浓度和类型,还有电流强度、缓冲液离子强度和超螺旋程度)
大多数情况,主要区别未处理的环状DNA样品和单一位点经限制酶作用线状化的同一DNA样品。
凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭:
溴化乙锭插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加,因此,线状DNA-染料复合物在凝胶中的迁移率约降低15%。
所用电压:
低电压时,DNA片段迁移率与所用电压成正比。;琼脂糖种类:见表1
电泳缓冲液:
DNA的泳动受电泳缓冲液组成和离子强度的影响。
适用于天然双链DNA的电泳:
TAE buffer(E buffer)
TPE buffer
TBE buffer
;表1 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围;三、凝胶载样缓冲液(loading buffer):
临上样前将样品和loading buffer进行混合。
loading buffer作用:
1、增加样品密度,以保证DNA沉入加样孔内;
2、使样品带有颜色,简化上样过程;
3、其中的染料(溴酚蓝、二甲苯氰FF)在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移,这一特性与琼脂糖浓度无关。;实验目的:;DNA分子在碱性环境中(pH8.3 buffer)带负电荷,在外加电场作用下,向正极泳动。不同的DNA片段由于其分子量大小及构型的不同,在电泳时的泳动速率不同,从而可以区分不同的区带。电泳后经溴乙锭(E.B.)染色,在波长254nm紫外光照射下,DNA显橙红色荧光。溴乙锭检测DNA灵敏度很高,10ng或更少的DNA即可检出。
线性DNA在凝胶中迁移距离(迁移率)与它的分子量大小的对数成正比。将未知大小DNA的迁移距离与已知分子大小的DNA标准物(DNA Marker)的电泳迁移距离进行比较,即可计算出未知DNA片段的大小。;1、用胶带或插板封住塑料托盘开放的两边形成一个模具,置于水平工作台上,将梳子插入模具,梳子距模具一端约1cm,梳齿底端距托盘表面保持0.5-1mm的间隙。
2、称取0.4g琼脂糖置于三角瓶中,加入40ml TAE buffer以配制1%的凝胶,使用电炉子加热直至琼脂糖完全熔化,期间轻轻摇匀。
3、待琼脂糖冷却至65℃左右(滴入E.B. 至终浓度为0.5μg/ml,轻轻摇匀,避免产生气泡),小心缓慢倒入模具内(避免产生气泡),使凝胶缓慢展开直至在托板表面形成一层约3mm厚的均匀胶层,室温下静置0.5-1h。;4、待凝固完全后,双手均匀用力轻轻拔出梳子(注意切勿使样品槽破裂),在胶板上形成相互隔开的样品槽。
5、将凝胶连同托板放入电泳槽平台上,倒入适量TAE buffer直至浸没过胶面2-3mm,小心除去样品槽中的气泡。
6、用微量加样器取样品(或DNA Marker)20ul,取6×loading buffer 5ul,与样品(或DNA Marker)缓慢混合均匀(避免气泡),将混合样加入样品槽内(注意避免因样品过多而溢出,污染邻近样品)。
7、加入样品后,将靠近样品槽一端连接负极,另一端连接正极,接通电源,开始电泳,在样品进胶前可用略高电压,防止样品扩散,样品进胶后,应控制电压不高于5V/cm(电压值V/电泳槽两极之间距离cm)。;8、当染料条带移动到距离凝胶前沿约1cm时,停止电泳。
9、将电泳后的胶板小心推至含0.5ug/mlE.B.染色液中,室温下浸泡染色30min(略)。
E.B.是诱变剂,强致癌物质,配制和使用时应带一次性手套,不要将该溶液洒到桌面或地面上,凡是E.B.污染过的器皿或物品,单独放置,必须经专门处理后,才能进行清洗或弃去。
10、小心取出凝胶
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