卡托普利和缬沙坦对兔动脉粥样硬化斑块中AngⅡ及CRP表达的影响.pdfVIP

山西医科大学磺士掌位论文 兔抗AnglJ 武汉博士德生物工程有限公司 APES 武汉博士德生物工程有限公司 SABC免疫组化试剂盒 武汉博士德生物工程有限公司 DAB显色试剂盒 武汉博士德生物工程有限公司 2方法 2．1实验分组 30只健康雄性新西兰兔，在山西医科大学动物实验中心山专人单笼饲养，进食量lOOg／ 只／天，自山饮水，每周更换蚺料一次。适应l周后进入实验。随机分为4组：(A组)高脂 2只分 正常对照组(n=6，实验过程中有1只于菊8周死于疾病)。对照组用基础饲料，高脂饮食 除基础饲料外每天加1％胆固醇和4％猪油。共10周。分别于0和lO周行腹主动脉超声， 看到血管内膜增厚，斑块形成提示成模。 2．2血脂检测 全部动物于10周术在清醒的状态下经兔中央动脉取空腹血标本(禁食12小时)，离心 (3000rpm，lOmin)，留取血i奇-20 定血清总胆固醇(total densil 蛋白一C(10w cholesterol—C，LDL—C)的浓度。 ty ipoprotein 2．3血浆AngII的检测 于第10周水在清醒的状态下经兔中央动脉取空血腹标本5ml，注入冰水冷却的含有 0．3mol／L 测定采用放射免疫法，操作过程严格按照说明书进行，批内变异系数(cV)：10％；批 问变异系数(CV)：15％。AngII的含量以pg／m1表示。 2。4病理形态学的检查 第10剧术，20％的乌拉坦5ml／kg处死动物，取其大动脉大体标本，从近主动脉弓 到骼总动脉分叉处，生理盐水冲沈后沿『F中线切丌。取近主动脉弓处及血管丌口处动脉组 织置于10％的中性祸尔马林缓冲液中浸泡固定48个小时，常规酒精脱水石蜡包埋，将其 横断面制成3nm厚的连续切片。分别做HE染色及AngII、CRP免疫组化染色。 2．5AnglI、CRP免疫组织化学染色方法 采月jS-P方法DAB显色，棕黄色颗粒状产物为阳性标记。二项均设阴性对照(PBS 代管一抗)。每组随机选取5个视野，阳性染色百分比为染色阳性面积／内膜面积。Olyumpus 碌微摄影系统，Mais-2000图像分析软件进行图像分析。具体步骤如下： (1)切片常规脱水，蒸馏水新鲜配置3％H她温室5一lO分钟以灭活内源性过氧化物酶， 蒸馏水洗3次。 3 山西压辩大学礤士学位沧文 @ 热修复抗原：切片浸入0．OIM枸橼酸缓冲澉(Pii6．0)微波炉加热至沸腾后断电删 隔5一lO分钟后，反复卜2次冷却后0．IMPBS冲洗卜2次。 抗原修复液充分暴露抗原：将其滴加在切片上室温5—10分钟后0．IMPBS沈2—3次。 滴加J下常小牛血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体不洗。 滴加稀释的一抗，工作浓度l：200，4℃过夜。0．IMPBS沈2分钟共3次。 滴加生物素化的羊抗兔IgG室温20分钟，0．IMPBS洗2分钟共3次。 @，“∞∞o∽ ；^^^) 滴加试剂SABC室温20分钟，0．IMPBS沈2分钟共3次。 DAB显色：使用DAB显色显色试剂盒，镜下观察控制反应时问，棕黄色颗粒状产物 为阳性标记。苏木素复染、脱水、透明、封片，显微镜观察。Olympus显微摄影系 统摄影。 2．6统计学处理 数据均以均数±标准差表示，采用SPSSII．0统计软件，对数据进行分析处理，百分 比数据经平方根反J下弦变换，组问比较采用单因素方差分析，相关性分析采用pearson相 关分析，PO．05为差异有显著性。 4